多糖类物质的研究进展_刘锐

1、多糖类物质的研究进展刘 锐 (仲恺农业技术学院食品系 , 广东 广州 510225摘要 阐述了多糖类物质的分离纯化 、 结构分析 、 生物活性及研究方向 。关键词 多糖 ; 分离纯化 ; 结构分析 ; 生物活性中图分类号 Q539 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2005 09-1722-041 多糖的研究概况多糖是除了蛋白质和核酸以外的一类重要的生物大分 子 , 虽然糖类的研究并不比蛋白质和核酸晚 , 但其研究层次 与水平还远远落后于蛋白质和核酸 。 20世纪 70年代以来 , 随着免疫物质 、 生物膜及多种生物活性物质的研究表明 , 糖 类在生物体内具有各种关键的生物学功能

2、, 因此糖类的研究 成为人们关注的焦点 。 大量的药理实验表明 , 多糖类化合物 具有免疫增强与调节 、 抗肿瘤 、 抗病毒 、 抗凝血 、 抗放射 、 抗衰 老等作用 。 日本自 20世纪 80年代以来 , 已有数种多糖应用 于临床 。 近年来 , 日本及欧美学者引进现代分子生物学技术 手段 , 加强对中药多糖活性决定簇等化学结构与功能关系的 研 究 , 并在柴胡 、 当归等中药的研究方面有了一定的突破 。 国内的研究起步较晚 , 虽然已在云芝糖肽 、 银耳多糖等的研 究中取得了一定的进展 , 但对药用多糖的研究仍多偏重于提 取 、 分离 、 精制 、 化学组成等方面 , 大多数品种尚处于实

3、验阶 段或仅用于滋补品和饮料 , 与国外相比仍有一定的差距 。 2 多糖的分离纯化与性质研究2. 1 多糖的提取 从不同的材料中提取多糖 , 一般都先用 有机溶剂如丙酮 、 乙醚 、 乙醇 、 甲醇或 1 1的乙醇乙醚混合液 脱脂 。 多糖可用水 、 0. 11mol /L 氢氧化钠或氢氧化钾碱性 水溶液 、 氯化钠溶液 、 1%醋酸 、 1%苯酚等作为提取溶剂 , 但 同一原料用不同试剂提取得到的多糖成分常常是不同的 1。 提取中要防止降解 , 用稀酸提取时时间宜短 , 温度最好不高 于 5, 用稀碱提取时 , 为防止降解 , 常通以氮气或加入硼氢 化钠 (钾 2, 稀酸稀碱提取后溶液应迅速

4、中和 。多糖提取液大多较粘稠 , 可进行吸滤或用离心法将不溶 性杂质除去 , 提取液经浓缩后 , 加入 25倍乙醇或甲醇沉淀 多糖 , 也可加入斐林试剂 、 硫酸铵或溴化十六烷基三甲胺等 使多糖生成沉淀 。 然后依次用乙醇 、 丙酮 、 乙醚洗涤 , 将吸干 后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷 /氢氧化钠的真空干 燥器中减压干燥 。 若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时可直 接冷冻干燥 。 干燥后的粉末状粗多糖 。除了以上的常规提取方法外 , 近年来酶法 、 超声波法在 多糖提取中的应用也得到了广泛的关注 35。2. 2 多糖的分级(1 分部沉淀法 。 根据不同多糖在不同浓度的低级醇 、 酮中具有不

5、同溶解度的性质 , 由小到大按比例加入甲醇 、 乙 醇或丙酮等进行分部沉淀 。 此法适宜于分离各种溶解度相 差较大的多糖 。作者简介 刘锐 (1975- , 男 , 河北衡水人 , 助教 , 从事食品发酵方 面的 教学与科研工作 。 (2 盐析法 。 不同多糖在不同盐浓度中溶解度不同 , 常 用的盐析剂有氯化钠 、 氯化钾 、 硫酸铵等 , 以硫酸铵最佳 。 此 法实际上是分部沉淀的一种 。(3 金属络合物法 。 多糖能与铜 、 钡 、 钙 、 铅离子形成络 合物沉淀 。 常用的络合剂有斐林试剂 6、 氯化铜 、 氢氧化钡 和醋酸铅等 。 得到的络合物沉淀用 5%无机酸乙醇溶液或硫 化氢分解

6、。(4 季胺盐沉淀法 。 根据季胺盐能与酸性多糖形成不溶 性化合物的特点 , 以分离酸性多糖 。 常用的季铵盐有十六烷 基三甲基溴化铵 (CT AB 和十六烷基吡啶 (CP C 。 一般地说 , 酸性强或分子量大的多糖首先沉淀出来 , 所以控制季铵盐的 浓度 , 能分离各种不同的酸性多糖 。 根据形成的沉淀能溶于 不同盐 、 酸溶液和有机溶剂中的性质 , 将多糖游离出来 。 (5 离子交换柱层析法 。 常用交换剂为 DE AE -纤维素 、 ECTEOL A -纤维素和羧甲基纤维素 。 此法适合于分离各种 酸性 、 中性及粘多糖 。 pH =6时 , 酸性多糖吸附于交换剂上 , 中性多糖不吸附

7、 , 然后用不同离子强度的缓冲液按酸性强弱 将各种多糖依次洗脱 。 洗脱方式可以是阶梯式或梯度式 。 若 p H 为碱性 , 中性多糖也能吸附 。 中性多糖还能与硼砂形 成络合物 , 若将柱处理成硼砂型后 , 改变硼砂液浓度也能将 不同中性多糖洗脱下来 。 另外 , 杂质会吸附于柱上端而达到 部分纯化的目的 。 多糖在柱上的吸附力与其结构有关 。 吸 附力一般随分子中酸性基团的增加而增大 。 对于线性分子 , 分子量大的比小的易吸附 , 直链多糖比分枝多糖易吸附 。 (6 凝胶柱层析 。 根据多糖分子大小和形状的不同实现 分离 。 常用的凝胶有葡聚糖凝胶 (Sephade x , Sephac

8、r yl 及琼脂 糖凝胶 (Sephe rose 。 也有人用 DEAE -Se pha dex 分离多糖 。 (7 制备性区域电泳 。 不同的多糖在电场作用下按其分 子大小 、 形状及所带电荷的不同而达到分离 。(8 超滤 7。 不同的超过滤膜排阻不同分子量和形状的 多糖通过 , 因而达到分离 。(9 亲和层析 。 如涂有聚芳香化合物的载体对分离某些 多糖很有价值 。 陈西广等 8根据多糖与抗血清能产生选择 性沉淀的特性 , 用伴刀豆蛋白 (Con A 与 Sepharo se 4B 作载体 分离纯化了甘露岩藻半乳聚糖 。(10 制备性高压液相色谱 (HPLC 。 HP LC 是在经典柱层

9、析原理的基础上 , 采用分布窄 、 粒径细的颗粒作载体 , 将流动 相以高压注入柱内 , 样品组分迅速而不断地在流动相和固定 相之间进行反复多次平衡分配 , 彼此分离 , 并向下迁移 , 迁移 速率依赖于各组分与固定相之间的相对亲和力 。2. 3 多糖纯度的鉴定 多糖纯度不能用通常的标准衡量 , 。安徽农业科学 , Journal of Anh ui Agri . Sci . 2005, 33(9 :1722-1725 责任编辑 朱永和 责任校 对 朱永和 DOI :10. 13989/j . cn ki . 0517-6611. 2005. 09. 085代表某一多糖相似链长的平均分布 。

10、通常所说的多糖纯品 实质上是一定分子量范围的均一组分 。 纯度鉴定方法有 : (1 超离心法 9。 微粒在离心力场中沉降速度与微粒的 密度 、 大小与形状有关 。 如果某一多糖在离心力场作用下形 成单一区带 , 说明微粒具有相同沉降速度 , 其分子密度 、 大小 和形状相似 。(2 高压电泳法 10。 多糖在电场作用下 , 按其形状 、 大小 及其所带电荷的不同而移动不同的距离 。 中性多糖虽然不 带电荷 , 但它的分子中若有顺式的邻二醇 , 就能与硼砂形成 复合物而带电荷 , 不同多糖的位阻因素决定了多糖与硼砂形 成不同的复合物 , 所以在电场作用下的相对迁移率不同 。 (3 比旋光度法 。

11、 不同的多糖具有不同的比旋光度 , 它 们在不同浓度的乙醇中具有不同溶解度 , 所以 , 如多糖水溶 液经不同浓度的乙醇所得沉淀物具有相同的比旋光度 , 则证 明该多糖为均一成分 。(4 凝胶柱层析 11。 多糖经凝胶色谱柱洗脱若只有一个 对称的峰 , 则表明该多糖为均一成分 。(5 高效液相色谱 12。 HPL C 测定多糖纯度具有速度快 、 分 辨率高和重现性好等优点 。 目前最 常用的商品柱是 -Bo nda gel 柱系列和 T SK 柱系列 。2. 4 多糖分子量测定 常用的多糖分子量测定方法有 :渗 透法 、 超离心法 、 高压电泳法 、 粘度法 、 超过滤法 、 还原末端 法 、

12、 聚合度法 、 光散射法等 。 随着耐压合成凝胶的出现 , 高效 液相色谱广泛应用于多糖的纯度和分子量测定上 13。 根据 糖的种类可以采用不同的分离方法 , 如反相色谱 、 常规氨基 烷柱液相色谱 、 高效离子交换色谱 、 凝胶渗透色谱 、 多胺修饰 的硅胶色谱 、 毛细管色谱等 。 实验室中最常用的是凝胶过滤 法 , 它根据在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱体积成一定 关 系的特性 , 用已知分子量的 Dextra n 系列标准葡聚糖制作 标准曲线 , 由样品的洗脱体积从曲线上求得分子量 。3 多糖的结构分析3. 1 多糖结构分析的化学方法(1 高碘酸氧化 14。 高碘酸可以选择性地断裂糖分

13、子中 连二羟基或连三羟基 , 生成相应的多糖醛 、 甲醛或甲酸 。 反 应定量进行 , 每开裂一个 C -C 键消耗一分子高碘酸 。 通过 测定高碘酸消耗量及甲酸的释放量 , 可以判断糖苷键的位 置 、 直链多糖的聚合度 、 支链多糖的分支数目等 。(2 Smith 降解 15。 是将高碘酸氧化产物还原后进行部 分酸水解 。 由于糖基之间以不同的位置缩合 , 用高碘酸氧化 后则生成不同的产物 。 将氧化产物用硼氢化合物还原成稳 定的多羟基化合物 , 经酸水解后用纸色谱或气相色谱鉴定水 解产物 , 由降解的产物可以推断糖苷键的位置 。(3 甲基化反应 16。 先将多糖中的各种单糖残基中的游 离羟

14、基全部甲基化 , 进而将多糖中的糖苷键水解 , 水解后得 到的化合物的羟基所在位置即为原来单糖残基的连接点 。 同时根据不同甲基化单糖的比例可以推测出这种连接键型 在多糖重复结构中的比例 。3. 2 多糖结构的仪器分析方法(1 色谱分析法 。 气相色谱法作为常规的糖类分析方 法 。 , 的灵敏度可进一步提高 。 多糖可通过酸水解或甲醇解成单 糖或单糖甙 , 然后采用三氟乙酰化 、 三甲基硅烷化 、 糖醇乙酰 化等方法衍生化 , 即可进样分析 17, 18。 高效液相色谱近年来 也广泛应用于单糖与低聚糖的分析 , 该方法不需衍生化可直 接进样 , 操作简便 , 而且有较高分辨率等优点 19。(2

15、 电泳法 。 毛细管电泳法与 HPL C 相比 , 基柱效更高 、 速度更快 , 样品用量仅为 HP LC 的 1%。 多糖的酸水解物经 衍生化后 , 以硼砂溶液为缓冲液 , 各种单糖组分均能被检出 , 尤其是在 HPL C 上不易分开的葡萄糖和甘露糖在毛细管电泳 中能得到较好的分离 20, 21。 Go ube t 等 22还报道了采用荧光 基团衍生化糖的还原末端和寡糖 , 并利用聚丙烯酰胺电泳研 究多糖的单糖组成及结构的快速定量方法 , 检测限可达到 500fmol 的单糖和 100fmol 的寡糖 。(3 红外光谱 23。 红外光谱图中的每一个吸收峰都相应 于分子中原子或官能团振动的情况

16、 , 利用红外光谱可以鉴定 多糖的结构 。 例如 , 吡喃糖的 -和 -的端基差向异构体 , 是 由端基的 C -H 变角振动造成的 。-型的差向异构体的 C -H 取平伏键 , 在 (844±8 c m -1处有一个吸收峰 ; -型的差向异构 体的 C -H 取直立键 , 在 (891±7 c m -1处有一个吸收峰 。 在多 糖分子中若存在甘露糖苷 , 则一定有 810及 870c m -1的特征 吸收峰 。(4 核磁共振 24。 1H NMR 主要解决多糖结构中糖苷键构 型问题 ; 13C NMR 的化学位移较 1H NMR 为广 , 分辨率高 , 不 但能确定各种碳

17、的位置 , 而且还能区别分子的构型和构象 , 特别是带有微型计算机的脉冲傅立叶转换方法在 13C NMR 上 的应用 , 使得 13C 天然丰度很低的糖能得到清晰的光谱 。 (5 质谱 。 早期的 质谱主要局限于电子解离 法 (EI -MS , 不适用于糖类这种极性强 , 难挥发高温下易分解的物 质 。 近年发展起来多种不需加热气化的软电离技术 , 其中应 用最广泛的是快原子轰击法 (F AB 。 FAB 法对于热不稳定或 难挥发化合物能给出强的准分子离子 , 便于测定其分子量 。 同时糖的 F AB 谱中 , 强度大的碎片离子往往是糖链断裂后的 各残基离子 , 据此可进行序列分析 。 由于上

18、述优点 , FAB 法 在糖的研究中得到广泛应用 25, 26。(6 X 射线衍射 27。 绝大多数多糖均不能形成单晶 , 不 适用于常规 X -射线单晶衍射 。 而 X -射线衍射的另一方式纤 维衍射则在这方面展示了越来越大的应用空间 , 再加上立体 化学方面的信息包括键角 、 键长 、 构型角和计算机模拟 , 就可 以准确的确定多糖的构型 。 尽管研究多糖的立体构型有多 种方法如电子衍射 、 旋光测定 、 核磁共振等 , 但 X -射线纤维衍 射与计算机模拟技术相结合仍不失为当前确定多糖立体构 型最为有力的工具 。4 多糖的生物活性4. 1 多糖的免疫调节作用 多糖对机体具有双向调节作 用

19、 , 适当浓度的多糖不仅能提高机体的特异性免疫功能 , 而 且能增强机体的非特异性免疫功能 28, 29。4. 1. 1 多糖对巨噬细胞的激活作用 。 巨噬细胞是体内非常 重要的免疫细胞 , 在抗感染免疫和抗肿瘤免疫等方面都起重 要的作用 。 但是 , 未活化的巨噬细胞的吞噬杀伤作用有限 , 。 大 172333卷 9期 刘 锐 多糖类物质的研究进展量实验表明 , 海带多糖 、 玉米花粉多糖 、 云芝多糖 、 黄芪多糖 、 枸杞多糖 、 牛膝多糖 、 香菇多糖等可激活巨噬细胞 , 增强其吞 噬作用 , 能诱导产生 IL -1, TN F -d 等细胞因子 3036。4. 1. 2 多糖对 T

20、、 B 淋巴细胞的激活作用 。 多糖化合物特别 是从高等植物中提取的多糖 , 可部分恢复并加强癌症和艾滋 病等患者的免疫功能 。 如白术多糖能明显提高外周血 T 淋 巴细胞 AN AE 染色率 , 说明其能促进淋巴细胞向成熟 T 淋巴 细 胞转化 , 提高小鼠细胞免疫功能 37。 当归多糖能直接激 活 B 细胞并对辅助性 T 细胞的功能具有间接激活作用 38。 香菇多糖是一个典型的 T 淋巴细胞激活剂 。 它在体内和体 外均能促进特异性细胞毒 T 淋巴细胞的产生 , 并提高其杀伤 活性 。 香菇多糖在体内还能提高辅助性 T 细胞的功能 , 提高 抗体依赖的细胞毒细胞活性 39。4. 1. 3

21、多糖对迟发型超敏反应 (DT H 的作用 。 L AC A 种小鼠 连续 15d 经口给予虫草多糖后在 6. 85mg /kg 剂量下可增强 小鼠迟发型变态反应 40。4. 1. 5 多糖对天然杀伤细胞的影响 。 人外周血单核细胞在 香菇多糖作用下促进 NK 细胞产生 , 增强细胞毒作用 41。 4. 1. 6 多糖对 LA K 细胞活性影响 。 近年来用 L AK /IL -2疗 法治疗肿瘤在临床上取得了明显疗效 , 但该疗法需要大量 I L -2和 L AK 细胞 , 而 IL -2的毒性及价格昂贵限制了它的使 用 。 用增强 L AK 活性 、 降低 IL -2用量而本身无毒性的生物 反

22、应修饰剂是改进该疗法的重要措施 。 研究表明 , 猪苓多糖 与 rIL -2有协同作用 , 可使内源性 L AK 活性显著提高 42。 灵 芝多糖能明显增强人脐血 LA K 细胞活性 , 并能协同 rI L -2提 高人脐血 L AK 细胞表面 IL -2受体的表达 43。4. 2 多糖的多种药效作用4. 2. 1 多糖的抗肿瘤作用 。 动物实验及临床观察表明 , 从 细菌 、 真菌 、 酵母 、 地衣和高等植物中提取的多种多糖均具有 抗肿瘤活性 , 表现在抑制肿瘤生长 、 抑制肿瘤转移 、 延长生命 存活期 、 提高宿主的免疫系统功能等 4447。 其中香菇多糖 、 裂裥多糖 、 猪苓多糖和

23、云芝糖肽等已进入临床应用 。 Ge resh 等发现硫酸化红藻多糖在 200mg /ml 浓度下对 T 细胞淋巴瘤 的抑制率可达到 80%以上 48。 某些多糖还能对抗化学剂 (如三甲基胆蒽 的致癌作用 49。 多糖作为抗癌剂的最大优 点是毒副作用少 , 与化疗联合应用有协同作用 , 还可以对抗 化疗药的骨髓抑制等不良反应 。4. 2. 2 抗感染 、 抗病毒作用 。 某些多糖通过增强宿主免疫 机制可以抵抗细菌 、 病毒和寄生虫的侵袭 。 据报道 , 香菇多 糖可用于治疗结核杆菌感染 , 患病超过十年且产生了耐药性 的肺结核病人用香菇多糖治疗一段时间后 , 病人痰菌转为阴 性 , 嗜中性粒细胞

24、吞噬活性增加 。 香菇多糖对泡状口角炎病 毒感染引起的 小鼠脑炎有 显著治疗 和预防 作用 , 治疗组 100%存活 , 而对照组全部死亡 。 香菇多糖对阿伯尔氏病毒 和十二型腺病毒感染也有效 , 其抗病毒作用与它诱生 IF N 和 提高 N K 活性有关 。 Ma rina 等发现红藻多糖能显著抑制逆转 录酶病毒的产生 50。 L ee 等报道了从 Antrodia c amphorata 5种 不同菌株的菌丝体中提取的中性多糖均具有抗乙肝病毒作 用 , 其中来自 B86菌株的多糖在浓度为 50mg /L 时抗乙肝病 , 1U /ml -I FN , 没有细胞毒性作用 51。4. 2. 3

25、抗缺氧 、 抗损伤作用 。 Y . N . Y e 等研究表明当归多糖 能显著促进正常胃上皮细胞的移动与增殖 , 具有促进胃粘膜 损伤修复与溃疡修复作用 52。 实验表明 , 从 C uscuta c hine nsis 种子中提取酸性多糖 CS -A -3不仅对淋巴细胞增殖与抗体 产生具有刺激作用 , 而且对过氧化氢诱导的细胞损伤具有保 护作用 53。 许燕萍等研究了麦冬多糖对脑缺血损伤的抗缺 氧作用 , 结果表明麦冬多糖可使缺血期间脑内乳酸含量下 降 , 从而可逆转缺血后酸中毒造成的各种损害 54。4. 2. 4 抗衰老作用 。 白花蛇舌草多糖 、 半枝莲多糖通过提 高 SOD 活力和对负

26、氧自由基的清除作用及抗脂质过氧化作 用等起到抗衰老作用 55。 王建华等用衰老模型小鼠和老年 小鼠等研究了枸杞多糖 (L BP 及其产品口含片的延缓衰老作 用 , 实验表明灌喂 LB P 能提高 D -半乳糖所致衰老小鼠体内 GS H -Px 和 SOD 活性 , 从而可以清除过量的自由基 , 降低 MDA 和脂褐素含量 , 起到延缓衰老的作用 56。 由实验还可知 LBP 在体外可直接清除羟自由基 , 并能抑制自发或由羟自由基引 发的脂质过氧化反应 。4. 2. 5 降血糖作用 。 实验证明 , 桑叶多糖对糖尿病小鼠糖 代谢有调整作用 , 并可促进正常大鼠胰岛素的分泌 。 张拥军 等以四氧嘧

27、啶型糖尿病小鼠的降血糖效果作为活性鉴定的 指标 , 逐步分离纯化 , 证明了南瓜中具有降血糖作用的活性 组分是大分子的多糖类物质 57。 另外 , 人参多糖 、 灵芝多糖 、 白术多糖 、 紫草多糖 、 山药多糖 、 薏苡仁多糖 、 稻糠多糖 、 麻黄 多糖等均具有降血糖作用 。4. 2. 6 抗炎症作用 。 Ma tsui 等报道了红藻硫酸多糖能抑制 人皮肤红斑的产生 , 体外实验表明多糖主要抑制多形核白细 胞向化学引诱物分子的迁移并能部分阻断多形核白细胞与 内皮细胞的粘附作用 58。4. 2. 7 抗凝血作用 。 Yoo n 等从 Pora na v olubilis 中提取平均 分子量为

28、 10kD a , 主要组成为半乳糖 、 半乳糖醛酸和甘露糖 的不含硫酸酯的多糖抗凝血剂 , 在肝素辅因子 II 介导下能增 强凝血酶抑制作用 59。5 多糖类物质的研究方向近 20年来 , 国内外各类多糖物质不断进入临床 , 主要集 中在抗感染 、 抗肿瘤 、 抗风湿 、 抗消化道溃疡和增进免疫功能 等方面 。 其报道的临床药理和适应征各有异同 , 多糖的基本 结构也各有异同 , 但大多数研究是基于体内外病理模型的药 效学实验 , 而缺乏其糖链的基本结构 、 体内代谢以及体内相 应配体作用机理的研究 。 因此每种多糖物质的多向药效作 用过于笼统 , 药理机理与结构基础研究尚在发展 。目前多糖

29、物质的进展有两方面 :一是根据多糖本身在消 化道药理与药代动力学原理 , 发展新型的降血脂 、 抗脂肪肝 、 抗高血糖 、 促进免疫功能等的治疗研究 。 二是依据多糖分子 结构为基础而阐明的生物学现象 , 合成与模拟体内多糖分子 或相应配体 , 或比天然多糖分子更有效的衍生物或类似物用 于疾病治疗 。 国外基于先进的基础研究大力发展此类物质 , 在抗炎症 、 抗肿瘤与抗病毒感染等方面已取得较大进展 。 参考文献1 S hid a M . Th e p rep aration an d p rop erities of so me p ol ysacch ari des from Canid a

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