实验二总糖和还原糖的测定(二)

1、实验二 总糖和还原糖的测定（二） 3,5二硝基水杨酸法 目的要求：  掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。 实验原理: 在NaOH和丙三醇存在下，3,5二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。黄色    桔红色试剂和器材一、试剂 3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取 DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/

2、L氢氧化钠溶液325ml，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000ml。葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为。 6mol/L HCl：取250ml浓HCl（35%38%）用蒸馏水稀释到500ml。碘碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。0.1% 酚酞指示剂。 二、材料藕粉，小麦淀粉或玉米淀粉。 三、器材723PC、S22型分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。一、葡萄糖标准曲线制作取5支15mm×180mm

3、试管，按下表加入葡萄糖标准液和蒸馏水。 管号葡萄糖标准液蒸馏水葡萄糖含量 OD540/ml/ml/mg0 1 010 2  3  4  5102操作方法   在上述试管中分别加入DNS试剂，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。以蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 二、样品中还原糖的提取准确称取 小麦（）粉，放在100ml烧杯中，先以少量蒸馏水(约2

4、 ml)调成糊状，然后加入40ml蒸馏水，混匀，于50 恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。  三、样品总糖的水解及提取准确称取小麦(玉米)淀粉，放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸馏水15ml，在沸水浴中加热，取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的

5、总糖水解液，用于总糖测定。  四、样品中含糖量的测定 取7支15mm×180mm试管，分别按下表加入试剂：项目空白还原糖总糖H2O/ml10000样品溶液/ml011113,5-二硝基水杨酸试剂/ml22222OD值/540nm 加完试剂后，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量。五、结果处理 按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量： 式中：C还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml；V还原糖或总糖提取液的总体积，ml； m样品重量，g；1000mg换算成g的系数。注意事项 标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比