大白菜永久高密度分子遗传图谱的构建

1、园 艺 学 报 2005, 32(2 :249255大白菜永久高密度分子遗传图谱的构建张立阳 1, 2 张凤兰 13 王 美 1 刘秀村 1 赵岫云 1 薛林宝 2(1北京市农林科学院蔬菜研究中心 , 北京 100089; 2扬州大学农学院园艺系 , 扬州 225009摘 要 :以大白菜高抗 Tu MV 白心株系 912112和高感 Tu MV 桔红心株系 T12219为亲本建立的小孢子培养 DH 系作为图谱构建群体 , 构建了包含 10个连锁群 、 406个标记位点的分子连锁图谱 , 图谱总长度82613c M , 标记间的平均图距为 210c M , 连锁群数目和染色体数相等 。 每个连锁

2、群上的标记数在 7111个 之间 , 连锁群的长度在 261415611c M 的范围内 , 平均图距在 110318c M 之间 。 该连锁图谱包括 246个AF LP 标记 、 135个 RAP D 标记 、 11个 SSR 标记和 12个同工酶标记 、 1个 SCAR 标记和 1个形态标记 。关键词 :大白菜 ; 分子标记 ; 遗传图谱 ; DH 群体中图分类号 :S 63413 文献标识码 :A 文章编号 :05132353X (2005 0220249207A L i n kage M ap Con structi on for Ch i n ese Cabbage Ba sed o

3、n AFL P, SSR, RAPD and Isozy m e M arkers Usi n g D H Popul a ti onZhang L iyang 1, 2, Zhang Fenglan 13, W ang Mei 1, L iu Xiucun 1, Zhao Xiuyun 1, and Xue L inbao 2(1N ational Engineering R esearch Center forV egetables, B eijing 100089, China; 2Horticultural D epart m ent, U niversi 2 ty, Yangzhou

4、 225009, China Abstract:A molecular genetic map f or Chinese lified Frag ment Length Poly mor phis m , RAP D (Si p le Sequence Repeat and is ozy me . was ly chosen DH lines obtained by m icr os pore 1w 912112and T12219. 406markers including 246AF LP D 11SSR markers, 12is ozy me markers, 1SCAR and 1m

5、or phol ogi 2 cal marker int o 10gr oup s using Join Map 310. It covered 82613c M with a mean marker inter 2 val of 210c M. Nu mber of markers included in linkage gr oup s varied fr om 7t o 111, mean marker interval dis 2 tance fr om 110c M t o 318c M and the length of linkage gr oup s fr om 2614c M

6、 t o 15611c M individually . A t otal of 4510%dist orted markers distributed in the map. The molecular genetic map constructed in this study would be useful in gene l ocalizati on, comparative genomes research and QT L mapp ing of i m portant agr onom ic traits for Chinese cabbage .Key words:Chinese

7、 cabbage; Molecular marker; Genetic linkage map; Double hap l oid (DH 大白菜 (B rassica cam pestris L. ss p. pekinensis 原产我国 , 是我国蔬菜栽培中分布最广 、种植面 积最大的蔬菜作物之一 , 其遗传学和分子生物学研究一直受到高度重视 。 分子连锁图谱为进行植物基 因组的结构分析和比较提供了有力工具 。 较高密度的分子图谱已有效的应用于数量性状的基因定位 、 比较基因组学研究和分子标记辅助育种等研究中 。关于大白菜 (种 遗传图谱的构建 , 国内外先后 有 Song 等 1 、

8、Teut onico 等 2 、 A jisaka 等 3 、 Tanhuanpaa 等 4 、 Matsumot o 等 5 、张鲁刚等 6 、于拴 仓等 7 报道 。 但上述研究主要存在 4个问题 :第一 , 使用的标记主要为 RF LP 和 RAP D 标记 。 RF LP 标记较为复杂 , 探针难以获得 , 不易进行大量单株筛选 ; RAP D 标记虽易于操作 , 但其稳定性较差 。 AF LP 技术结合了 RF LP 和 RAP D 的特点 , 稳定性较好 , 在一次 PCR 反应中能同时检测多个遗传位点 , 收稿日期 :2004-06-02; 修回日期 :2004-10-16基金项

9、目 :北京市科技新星项目 (954812900 ; 国家 863 项目 (2001AA241124, 2002AA2070123通讯作者 Author f or corres pondence (E 2mail:zhangfenglannercv 1com 园 艺 学 报 32卷信息量非常丰富 。 SSR 标记所揭示的多态性也十分丰富 , 相对于 RAP D , 重复率和可信度高 , 逐渐成 为遗传标记中的研究热点 。 第二 , 目前构建的遗传图谱大多利用亚种间杂交获得的群体 , 对于指导育 种来说 , 选用品种间杂交组合更贴近育种目标 , 可以获得许多重要农艺性状完整的遗传信息 。第三 ,

10、图谱的密度不高 , 目前大白菜品种间组合所获得的图谱标记密度低 , 尚不能满足农艺性状定位和基因 组研究的要求 。 第四 , 大多数图谱是利用 F2群体构建的 , 为非永久性群体无法继续将其饱和 , 很难 与其它实验室合作进行比较研究 , 同时很难准确地对大白菜数量性状进行定位 。 采用永久群体如 DH 群体与重组自交系进行分子图谱的构建已成为国际上的主流方向 。本研究对大白菜普通白心株系 912112和桔红心株系 T12219杂交 F1进行游离小孢子培养 , 以得到 的 100个 DH 株系为作图群体 8 , 采用 AF LP 标记 、 SSR 标记 、 RAP D 标记 、 同工酶标记 、

11、 SCAR 和形 态标记等 , 构建了永久高密度的大白菜分子连锁图谱 , 可为重要农艺性状的基因定位和标记辅助育种 研究参考 。1 材料和方法大白菜普通白心株系 912112为连续自交 9代的高代自交系 , 球心为白色 , 叶面较平 , 叶球叠抱 ,高抗芜菁花叶病毒 (Tu MV 。 T12219是通过对北京地方品种和日本引进品种的杂种 F1进行小孢子培 养得到的双单倍体株系 , 球心为桔红色 , 植株生长势弱 , 高感芜菁花叶病毒 。 对 912112和 T12219的 F 1进行小孢子培养 , 得到 100个双单倍体株系 , 作为白菜构建连锁图谱的分离群体 。采用 CT AB 法提取基因组

12、 DNA, 按 Murry 等 9 的方法进行 10 的 方法 。参照 Vos 的方法 11 进行 AF LP 分析 , AF LP 2BRL剂盒说明书进行 , 稍有改动 , 反应体积减半 。 DNA i o 2Rad, America 上分离 , 。RAP D L 0L 25mmol/LMgCl 2, 210L 215mmol/L d NTP, 1U , ng , 50ng 模板 DNA 。热循环程序为 :94 预变性 4m in, 然后 94 15s, 3730s, 72 75s 下循环 45次 , 72 延伸 7m in 后保存在 4 条件下 。 采用 114%琼脂 糖 (含 015mg

13、 /LEB 凝胶 , 80V 电泳 2h 。 用 Kodak EDAS 2120凝胶成像系统照相分析 。SSR 引物序列参照 Sze wc 等 12 引物序列由 Sangon 公司合成 。 20L 反应体系含有 1PCR buffer, 31125mmol/LMgCl 2, 0125mmol/LdNTPs, 110mol/L引物 , 30ng 模板 DNA , 1U TaqE 。 反应程序 为 :94 预变性 2m in, 94 变性 60s, 68 退火 30s, 72 延伸 45s, 进行 2个循环 , 以后每 2个循 环降低退火温度 1 直到 58 , 最后 94 变性 60s, 58

14、退火 30s, 72 延伸 45s 进行 20个循环 。 扩增产物用 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 55W 预电泳 1h 后 , 60W 电泳约 115h, 直至二甲苯青 跑到胶的 2/3处为止 , 停止电泳 , 进行银染分析 。同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳 , 凝胶制备参照周顺伍的 13 的方法 , 分离胶的浓度 是 7%, 浓缩胶浓度是 3%, 在 4 条件下 300V 恒压电泳 。 染色参照王中仁 10 的方法进行 。用 10%的甘油制成干胶保存或照相记录电泳结果 。数据整理将各个株系的带型按亲本类型分类 , 与 912112带型相同者赋值为 A, 与 T12219带型相

15、同者赋值为 B , 由各种原因造成的数据不清或缺失者赋值为 “ -” 。 根据与 100bp DNA ladder 标准谱 带的相对位置 , 估计多态性条带的分子量大小 。 RAP D 和 SSR 标记名称用引物名称加扩增片段的碱基 长度表示 , 由于 AF LP 采用的是 (E +A /(M +C 组合 , 所以 AF LP 标记用引物中后两个选择性碱 基组合加扩增片段大小表示 。 两个选择性碱基组合之间用 “ -” 分开 。连锁分析利用 Join Map 310 14, 15 软件构建大白菜遗传图谱 。先用 “ Ne w p r oject ” 命令创建一个新 的文件 , 用 “ Load

16、 data ” 命令导入数据 ; 然后 , 在 “ I ndividual genot . freq ” 下排除缺失数据过多的 052 2期 张立阳等 :大白菜永久高密度分子遗传图谱的构建 单株 , 在 “ Locus genot . freq ”下分析标记的偏分离情况 ; 最后将 LOD 值的范围设定为 “ 2”到 “ 10” , 用 “ Gr oup ” 命令进行分组 ; 选用 “ Kosa mbi ” 函数计算图距 , 用 “ Map ” 命令构建连锁图谱 。2 结果与分析211 分子标记多态性利用亲本与 F1代进行 AF LP 引物组合的筛选 , 最后从 64对引物中筛选出 20对条带

17、清晰 、 多态性 高的引物组合进行 AF LP 分析 。 20对引物共产生 810个条带 , 平均每个引物扩增出 4015条带 。 810个位点中 263个位点在双亲间具有多态性 , 占 3215%。 263个多态性位点中有 26个标记为共显性标 记 , 占 919%。对 462个 RAP D 引物进行分析 , 筛选出在双亲间稳定表现多态的引物 99个 。其共产生 406条扩 增谱带 , 平均每个引物扩增 411条带 , 其中多态性谱带 150条 , 占 3215%。 150个多态位点中有 2个 共显性标记 , 占 113%。对 15个 SSR 引物对进行分析 , 其中 6对引物产生的扩增产物

18、多态性明显 , 带型清晰且稳定性好 。 6对 SSR 引物共产生 17个多态性位点 , 多态率为 218条 /引物对 。通过对天 冬 氨 酸 转 氨 酶 (AAT 、苹 果 酸 脱 氢 酶 (MDH 、苹 果 酸 酶 (ME 、乳 酸 脱 氢 酶 (LDH 、 磷酸葡萄糖变位酶 (PG M 、甲酸脱氢酶 (F DH 、谷氨酸脱氢酶 (G DH 7种同工酶进行 电泳分析 , 得到在双亲间表现差异的谱带 14条 , 其中共显性标记 10个 , 占 7114%。212 遗传图谱的构建对 446个多态性标记进行分析构图 , 得到包含 406、 10(图 1, 表 1 , 其中包括 246个 AF LP

19、 标记 , 135个 RAP D 标记 , 11个 12SCAR 标记和 1个形态标记 。 总长度为 82613c M , 111个之间 , 连锁群的长度在 26141561, 101之间 。 406个分子标记中 , 来自父本的标记为 222个 , 占 54184个 , 占 4513%, 符合 1 1的理论分离比 。 各位点上 , 912112的 基因频率 为 796%2317%, 平 均 为 51165%; T12219的 基 因 频 率 为 2014%7613%, 平 均 为 48135%。 所以 , 亲本在群体中的分离比例接近 , 说明该群体总体上没有出现严重的偏分离 。试验分析的 44

20、6个标记中 , 有 910%的标记未进入连锁群 , 包括 17个 AF LP 标记 、 15个 RAP D 标 记 、 6个 SSR 标记和 2个同工酶标记 (表 1 。 10个连锁群中 , LG1包含的标记最多 , 有 111个 , LG8最少 , 只有 7个 。 标记在 LG1、 LG4和 LG5上的分布不均匀 , 分别出现不同程度的标记密集区 , 尤其 是 AF LP 标记 ; 其余连锁群上的标记分布比较均匀 , 只有 03个间距大于 10c M 的空隙 。 LG8的平均 图距最大 , 为 3177c M; LG6的平均图距最小 , 为 110c M (表 2 。表 1 构建遗传图谱的分

21、子标记Table 1 M olecul ar markers used for geneti c map con structi on分子标记 Molecular marker 多态性标记数 /引物对Number of poly mor phicmarkers/pri m ercombinati on偏分离标记数Number ofdist ortedmarkers偏分离标记比率Rate of dist ortedmarkers (%连锁标记数Numberof linkedmarkers未连锁标记数Number ofunlinked markers未连锁标记比例 Rate of unlinked

22、 markers (%SSR 17/6 654151163513SCAR 1/- 00 100形态标记 Mor phol ogical marker 1/- 00 100152 园 艺 学 报 32 卷 252 2期张立阳等 :大白菜永久高密度分子遗传图谱的构建 图 1 用 D H 群体构建的大白菜分子连锁图“ 3” 和 “ 33” 表示标记的分离偏离理论分离比例 1 1, 3:P 005, 33:P 0101。F i g . 1 The li n kage map con structed w ith D H ti on i n i n ese 3 and 33 indicate marke

23、rs showing deviati ons fr om the expected 1 1o, 3:0105, :0213 偏分离分析在 , 即表现 ; 在 水平上有 70个位点偏离孟德尔分离比例 , 即表现显著偏分离 , 比率为 1713%, 偏向 912112者占 6615%, 偏向 T12219者占 3315%。从偏分 离位点的分布来看 , 除了 LG10没有偏分离位点外 , 其余均有 , 其中 LG2、 LG3和 LG6均为偏分离标 记 。 大部分偏分离标记在连锁群上表现为多个位点集中分布 , 如 LG9的两端 , LG7的下半部分 。 LG2、 LG3、 LG8和 LG9上的偏分离标

24、记全部偏向 912112, LG6上的偏分离标记全部偏向 T12219, 其余连锁群中除了 LG10外 , 大部分偏向 912112(表 1、 表 2 。表 2 分子标记在遗传图谱上的分布Table 2 D istr i buti on of m olecul ar markers on li n kage map连锁群L inkage gr oup LOD 值LOD score长度 Length(c M 标记数Number of markers 平均距离Average distance (c M 偏 T12219标记数Number of markers dist orted t o T122

25、19偏 91212标记数Number of markersdist orted t o 91212偏分离标记数Number of dist orted32LG77102194221522224LG842614 73180 5 5LG9377183621201919LG1095812202190 0 0总计 Total-8261340621061121182352 254 园 艺 学 报 32 卷 3 讨论 本研究主要利用 AFLP、 RAPD、 SSR 和同工酶标记构建大白菜连锁图谱 , 由结果可知多态性检出 效率 : AFLP SSR RAPD。说明 AFLP是一种多态性丰富 , 高通量的分

26、子标记类型 , 对于构建图谱 和增加图谱密度是高效的 。这与 M cGregor 16 的试验结果一致 。 外 , 尚与所用材料和群体的种类有关 。构建的遗传图谱大小与作图群体双亲间遗传差异的大小密切相 关 , 当双亲间遗传距离大 , 差异位点多 , 且在染色体上分布均匀时 , 构建的遗传图谱较长 , 也更接近 基因组实际 。本研究中采用 91 2 和 T12 2 两个大白菜品种间杂交产生的 DH 群体为作图群体 , 是 112 19 导致覆盖基因组较小的原因之一 。此外 , 由于本研究中的主要标记为 EcoR I2 se I AFLP 标记 , 其在染 M 色体上的簇状排列可能是导致基因组覆

27、盖面积小的又一原因 。 EcoR I2 se I AFLP 标记检测的位点多聚 M 集在着丝粒两侧甲基化较高的重复序列区域 , 标记聚集而形成 “ ” 这种现象可能与异染色质区重 簇 , 组率低有关 。该缺陷可以利用不同分子标记特性的互补来弥补 , 如 Pst I2 se I AFLP 标记 , Pst I可以在 M 非甲基化的常染色质区识别酶切位点 , 另外在连锁图中增加 RFLP标记可以增加标记在染色体上分布 的均匀性和图谱的稳定性 。 本研究 中 偏 分 离 标 记 的 频 率 ( 4510% 比 芸 薹 属 其 他 研 究 ( Teutonico 等 , 23% ; Chyi 等 ,

28、24% 17 2, 中的频率高 。异常分离现象在自然界中普遍存在 , 在远缘杂交组合的分离群体及 DH 和 R I 群体中尤为明显 。导致偏分离现象的原因很多 , 主要有 : ( 1 由配子体或孢子体不同发育阶段基因 型的选择所造成 。A jisaka等 18 与 RAPD 标记分离相关性进行研究 。结果表明 , 多数 RAPD 标记出现偏分离频率与胚状体发生能力成 正相关 , 这从一个侧面证实了配子体或合子的选择性是形成偏分离的主要原因 。 ( 2 由小孢子培养 和植株再生过程的选择压造成 。DH 群体来自雄配子体的花粉培养 , 花粉培养导致的偏分离可能偏向 22 19, 高花粉培养反应能力

29、的亲本 , 这在玉米和白菜的 DH 群体中已有报道 。 ( 3 由于遗传搭车效应 , 与影响偏分离的遗传因子紧密连锁的分子标记表现为严重的偏分离 。 ( 4 与 F2群体相比 , DH 群体中 隐性有害基因的选择压增大 , 很可能导致偏分离的发生 。此外 , 环境因素和群体的随机效应也会引起 偏分离 。对芸薹属作物曾有偏分离标记集中分布于某几个连锁群的特定区域内 , 并明显偏向某一亲本 型的研究报道 20 偏分离标记全部偏向 T12 2 19, 该结果与 Moriguch 参考文献 : 锁图谱 , “ ap ”命令对每个连锁群根据标记间连锁的紧密程度进行 1 3 次不等的标记添加 , 对于含

30、M 有较多偏分离标记的连锁群不宜采用经过 3 次添加才构成的 , 以选取第 2 次添加后所得的连锁群为 宜 , 这样既可避免丢失有效标记 , 又可避免由于过多添加偏分离标记导致连锁图失去真实性 。 综上所述 , 对于具有重要经济价值的大白菜来说 , 构建一张永久高密度的遗传连锁图具有重要的 意义 。本研究采用永久群体 (双单倍体群体 、利用 AFLP、 RAPD、 SSR 和同工酶等多种分子标记构 建了高密度大白菜分子遗传图谱 , 标记间的平均距离只有 210 cM , 可为今后进行白菜重要性状精细 的 QTL (数量性状位点 定位作参考 。 fragment length polymorph

31、ism loci Theor App l Genet , 1991, 82: 296 304 . . . . oleracea and A rabidopsis tha liana. Theor App l Genet , 1994, 89: 885 894 . . . 1 ( 1850 cM , 280 个标记 和 本研究所得到的大白菜遗传图谱总长度为 82613 cM , 约为 Song等 2 ( 1785 cM , 139 个标记 所构建图谱的 1 /2。笔者认为图谱大小除与基因组大小有关 Teutonico 等 1 Song K M , Suzuki J Y, Solcum M K,

32、W illiovm s P H, O sborn T C. A linkage map of B rassica rapa ( syn. cam pestris based on restriction 2 Teutonico R A , O sborn T C. Mapp ing of RFLP and qualitative trait loci in B rassica rapa and comparison to the linkage map s of B. napus, B. 3 A jisaka H, Kuginuki Y, H ida K, Enomoto S, H irai

33、M. A linkage map of DNA markers in B rassica cam pestris. B reed. Sci , 1995, 45 . 。本研究中 , LG2、LG3、LG8 和 LG9 上的偏分离标记全部偏向 91 2 112, LG6 上的 21 曾对 B 1 cam pestris的游离小孢子培养过程中 F2代单株胚状体发生能力 的研究结果相似 。利用 JoinM ap 310 中软件构建连 2 期 ( Supp l : 195 . 张立阳等 : 大白菜永久高密度分子遗传图谱的构建 255 10 王中仁 . 植物等位酶分析 . 北京 : 科学出版社 , 19

34、96. 82 85, 91 102 11 Vos P, Hogers R, B leckerM , R igansM , Lee T, HornesM , FritersA , Pot J, Peleman J, KniperM , Zabeau M. AFLP: a new technique for DNA fingerp rinting Nucl Acids Res , 1995, 23: 4407 4414 . . . 12 Szewc2 cFadden A K, Kresovich S, B liek S M , M itchell S E, Mcferson J R. Identi

35、fication of polymorphic, conserved simp le sequence re2 W peats ( SSR s in cultivated B rassica species Theor App l Genet , 1996, 93: 534 538 . . . . 13 周顺伍 . 基础生化试验技术 . 北京 : 北京农业大学出版社 , 1989. 100 200 Zhou S W. B iochem ical experim ental techniques Beijing: Beijing Agricultural University Press, 19

36、89. 100 200 ( in Chinese . 14 Stam P. Construction of integrated genetic linkage map s by means of a new computer package: JoinMap. Plant J. , 1993, 3: 739 744 Netherlands, 1995. 1 51 15 Stam P, Van Ooijen J W. JoinMap ( tm version 310: Software for the calculation of genetic linkage map s CPRO 2 .

37、DLO , W agerningen, The 16 McGregor C E, Lambert C A , Greyling M M , Louw J H , W arnich L. A comparative assessment of DNA fingerp rinting techniques ( RAPD , ISSR, AFLP and SSR in tetrap loid potato ( Solanum tuberosum L. germp lasm. Euphytica, 2000, 113: 135 144 17 Chyi Y S A genetic linkage map

38、 of restriction fragment length polymorphis loci for B rassica rapa ( syn. cam pestris . Genome, 1992, 35: . m 746 757 18 A jisaka H, Kuginuki Y, ShiratoriM , Ishiguro K, Enomoto S, H iraiM. Mapp ing of loci affecting the cultural efficiency of m icrospore culture of B rassica rapa L. syn. cam pestr

39、is L. using DNA polymorphism. B reed Sci , 1999, 49: 187 192 . 968 975 19 Beaumont V H, Rocheford T R, W idholm J M. Mapp ing the anther culture response genes in maize ( Zea m ays L. . Genome, 1995, 38: 20 L incoln S E, Daly M J, Lander E S Constructing genetics map s with MAPMAKER / EXP 310 b. A W

40、 hitehead Institute Technical Report, . 2nd ed. 1993, 1 100 acea. B reeding Science, 1999, 49 ( 4 : 257 265 21 Moriguch K A genetic map based on RAPD , RFLP, isozyme morphological markers and QTL analysis for clubroot resistance in B rassica oler2 . 22 Zhang F L, Aoki S, Takahata Y RAPD markers linked to m icrospore embryogenic ability in B rassica crop s Euphytica, 2003,