第6章基因操作中大分子的分离和2013

1、补课安排补课安排第第7周周周周7第第11节节N1-104第第8周周周周3第第7节节N1-121 第第 六六 章章 基因操作中大分子的分离和分析基因操作中大分子的分离和分析第一节第一节 DNADNA的分离、检测和纯化的分离、检测和纯化第二节第二节 RNARNA的分离、检测和纯化的分离、检测和纯化第三节第三节 分子杂交分子杂交第四节第四节 RNARNA作图和端点分析作图和端点分析第五节第五节 重组重组DNADNA分子导入大肠杆菌分子导入大肠杆菌第一节第一节 DNA的分离、检测和纯化的分离、检测和纯化一、大肠杆菌质粒一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化的分离和纯化二、二、DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖

2、凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳四、脉冲场凝胶电泳四、脉冲场凝胶电泳五、五、DNA片段的纯化片段的纯化一、大肠杆菌质粒一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化的分离和纯化依据是利用分子依据是利用分子大小大小不同和质粒不同和质粒DNA的的超螺旋超螺旋共价闭合环状结构共价闭合环状结构的特点来进行分离。的特点来进行分离。目前最常用的是目前最常用的是碱裂解法碱裂解法。1 碱裂解法提取大肠杆菌质粒碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA原理原理 碱裂解法碱裂解法是基于染色体是基于染色体DNA与质粒与质粒DNA变性与复变性与复性的差异性的差异而达到分离目的。而达到分离目的。在在pH高达高达12.5的碱

3、性条件下，染色体的碱性条件下，染色体DNA的氢键的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链链不会完全分离不会完全分离。当以当以pH4.6的的KAc高盐缓冲液调节其高盐缓冲液调节其pH至至中性中性时，时，变性的质粒变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在又恢复原来的构型，保存在溶液溶液中中，而染色体，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结不能复性而形成缠连的网状结构。构。通过离心，染色体通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNA、蛋白质蛋白质

4、-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。复合物等一起沉淀下来而被除去。碱抽提法所用试剂的生化作用碱抽提法所用试剂的生化作用 提取过程提取过程中所用的材料有中所用的材料有LBLB培养基、葡萄糖培养基、葡萄糖/Tris/EDTA/Tris/EDTA溶液溶液(5Ommol/L(5Ommol/L葡萄糖；葡萄糖；25mmol/L 25mmol/L TrisHClTrisHCl；pH8.0pH8.0，lOmmol/L EDTA)lOmmol/L EDTA)、TETE缓冲缓冲液、液、3mol/L3mol/L乙酸钾溶液、乙酸钾溶液、NaOH-SDSNaOH-SDS溶液、溶溶液、溶菌酶液、异丙醇、菌酶液、异丙醇、

5、100%100%乙醇和乙醇和70%70%乙醇等。乙醇等。 溶菌酶溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌体溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1,4糖苷键，因而具有溶菌作用。糖苷键，因而具有溶菌作用。 葡萄糖葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，葡萄糖增加溶液粘度，维持渗透维持渗透压压，防止，防止DNA受机械剪切力作用而降解。受机械剪切力作用而降解。 EDTA:EDTA螯合螯合Mg2+和和Ca2+等金属离子，等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用的降解作用,同时有利于溶菌酶的作用。同时有利于溶菌酶的作用。 NaOH-SDSNa

6、OH-SDS液液: :NaOHNaOH浓度为浓度为0.2 mol/L0.2 mol/L，加，加抽提液时，该系统的抽提液时，该系统的pHpH就高达就高达12.612.6，因，因而促使染色体而促使染色体DNADNA与质粒与质粒DNADNA的变性。的变性。SDSSDS是是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因溶解膜蛋白而膜上的脂质与蛋白，因溶解膜蛋白而破破坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋白坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋白，还能，还能与蛋白质结合成为与蛋白质结合成为R-O-S0R-O-S03 3- -RR+ +- -蛋白质蛋白质的复合物的复合物, ,使蛋白质变性沉淀

7、下来。使蛋白质变性沉淀下来。KAc:KAc: pH4.8pH4.8的的KAcKAc溶液是为了把溶液是为了把pHl2.6pHl2.6的的抽提液调节至中性，使变性的质粒抽提液调节至中性，使变性的质粒DNADNA能能够复性，并能稳定存在。够复性，并能稳定存在。高盐高盐3mol/L KAc3mol/L KAc有利于变性的大分子染色有利于变性的大分子染色体体DNADNA、RNARNA以及以及SDS-SDS-蛋白复合物的凝聚蛋白复合物的凝聚而沉淀。染色体而沉淀。染色体DNADNA因为中和了核酸上的因为中和了核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，钾盐与电荷，减少相斥力而互相聚合，钾盐与RNARNA、SDS-S

8、DS-蛋白复合物作用后，形成钾盐蛋白复合物作用后，形成钾盐形式复合物，使沉淀更完全。形式复合物，使沉淀更完全。 无水乙醇无水乙醇: :沉淀沉淀DNADNA，它的优点是可以任，它的优点是可以任意比例和水相混溶，且乙醇与核酸不会意比例和水相混溶，且乙醇与核酸不会起任何化学反应，对起任何化学反应，对DNADNA很安全。很安全。DNADNA溶溶液是液是DNADNA以水合状态稳定存在，当加入乙以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去醇时，乙醇会夺去DNADNA周围的水分子，使周围的水分子，使DNADNA失水而易于聚合。失水而易于聚合。 酚酚- -氯仿氯仿: :酚与氯仿是非极性分子，水是酚与氯仿是非极

9、性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的水相下面，从而与溶解在水相中的DNADNA分分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。留在最下层。异戊醇异戊醇: :异戊醇能异戊醇能降低分子表面张力降低分子表面张力，能，能减少抽

10、提过程中泡沫的产生。同时异戊减少抽提过程中泡沫的产生。同时异戊醇醇有助于分相有助于分相，使离心后的上层水相、，使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。持稳定。 152 通过试剂盒分离纯化大肠杆菌质粒DNA 二、二、DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳1、凝胶电泳的基本原理、凝胶电泳的基本原理一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。它与电场强度和电泳分度移向适当的电极。它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。就是说，子本身所携带的净电荷数成正比。就是说，电场强度越大，电泳

11、分子所携带的净电荷数电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度越快，反之则较慢。量越多，其迁移的速度越快，反之则较慢。电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳迁移率。迁移率。2、影响电泳迁移速率的因素：、影响电泳迁移速率的因素：1 ） 分子筛效应分子筛效应DNA分子在高于等电点的分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度

12、向正极方向移动。在一定的因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效分子的迁移速度取决于分子筛效应，即应，即DNA分子本身的大小和构型。分子本身的大小和构型。 2）相对分子质量）相对分子质量具有具有不同的相对分子质量不同的相对分子质量的的DNA片段泳动速度不一片段泳动速度不一样，可进行分离。样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。比关系。当提取到的质粒当提取到的质粒DNA样品中还有染色体样品中还有染色体DNA或或RNA时，在凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带，由时，

13、在凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。此可分析样品的纯度。 3）构型）构型质粒质粒DNA超螺旋超螺旋(SC)、开环状、开环状(OC)、线状、线状(L) 3种构型种构型的分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型的分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型分子迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开分子迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开环状分子。环状分子。3、DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳1）DNA的显示原理：的显示原理： 制备琼脂糖凝胶时加入制备琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭溴化乙锭指示剂，溴化乙指示剂，溴化乙锭锭(EB)在紫外光照射下能发射在紫外光照射下能发射桔

14、红色的荧光桔红色的荧光。荧光的强度荧光的强度正比于正比于DNA的含量。若用的含量。若用薄层分析扫描仪薄层分析扫描仪检测，只需要检测，只需要5lO ng DNA，就可以从照片上比较，就可以从照片上比较鉴别。如用鉴别。如用肉眼肉眼观察，可检测到观察，可检测到0.010.1g的的DNA。EB染色原理染色原理当当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的的EB就插入就插入DNA分子中形成荧光络合物，使分子中形成荧光络合物，使DNA发发射的荧光增强几十倍。射的荧光增强几十倍。分离不同大小分离不同大小DNADNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度片段的合适琼脂糖凝胶浓度2）

15、琼脂糖凝胶电泳的操作过程）琼脂糖凝胶电泳的操作过程A、缓冲液制备缓冲液制备B、EB母液配制：母液配制：10mg/ml，在，在4下保存下保存C、将点样梳洗净干燥放入胶板中将点样梳洗净干燥放入胶板中D、琼脂糖胶板的制备：琼脂糖胶板的制备： 称量加入三角瓶一定的琼脂糖粉末，按所需凝称量加入三角瓶一定的琼脂糖粉末，按所需凝胶浓度加入适量体积的缓冲液，将三角瓶塞口，微胶浓度加入适量体积的缓冲液，将三角瓶塞口，微波炉中波炉中融化融化。 融化好后冷却到融化好后冷却到60左右，加入左右，加入EB溶液，至最溶液，至最终浓度为终浓度为0.5ug/ml。摇匀倒入放置好点样梳的胶板。摇匀倒入放置好点样梳的胶板中，排走

16、气泡。室温放置中，排走气泡。室温放置30-45min。2）琼脂糖凝胶电泳的操作过程）琼脂糖凝胶电泳的操作过程E、加样和电泳：加样和电泳： 将胶板放入电泳槽，注入缓冲液，使液面高于将胶板放入电泳槽，注入缓冲液，使液面高于胶面胶面1-2mm，排出加样孔内的气泡，用微量移液枪，排出加样孔内的气泡，用微量移液枪加入加入DNA样品。接通电源，调好电压和电泳时间。样品。接通电源，调好电压和电泳时间。可根据可根据溴酚兰的位置溴酚兰的位置结束电泳，关闭电源。结束电泳，关闭电源。F、取出凝胶，置于紫外投射仪上，调好相机焦距拍取出凝胶，置于紫外投射仪上，调好相机焦距拍照照2）琼脂糖凝胶电泳的操作过程）琼脂糖凝胶电

17、泳的操作过程2）琼脂糖凝胶电泳的操作过程）琼脂糖凝胶电泳的操作过程常用的常用的Marker三、聚丙烯酰胺凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳特点：特点：分辨率高分辨率高适于寡聚核苷酸及适于寡聚核苷酸及DNA序列分析，序列分析，DNA500bp载样量大载样量大回收回收DNA纯度高纯度高PAGE装置电 泳PAGE应用范围分离、纯化和鉴定分离、纯化和鉴定RNA和小分子和小分子DNA DNA序列分析序列分析 PCR产物鉴定产物鉴定 蛋白质的检测和分析蛋白质的检测和分析 四 、四 、 脉 冲 场 凝 胶 电 泳脉 冲 场 凝 胶 电 泳 ( p u l s e d - f i e l d g e l elec

18、trophoresis PFGE)采用定时改变电场方向的交变电源采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改，每次电流方向改变后持续变后持续1秒到秒到5分钟左右，然后再改变电流方向，分钟左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。专门针对专门针对大片段大片段DNA的分析检测方法。的分析检测方法。+- - -2五、五、DNA片段的纯化片段的纯化DNA经过酶切并通过琼脂糖凝胶电泳分析在凝胶上会经过酶切并通过琼脂糖凝胶电泳分析在凝胶上会呈现呈现DNA条带条带，从中分离特定大小的，从中分离特定大小的DNA片段可用片段可用于进一步深入的研究。于进一

19、步深入的研究。常用的常用的DNA纯化方法有：纯化方法有：低熔点琼脂糖凝胶电泳法低熔点琼脂糖凝胶电泳法、透析袋电洗脱法透析袋电洗脱法、氯化铯、氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心法、溴化乙锭连续梯度离心法、离子交换层析法、离子交换层析法、 “基因纯基因纯”试剂纯化等。试剂纯化等。低熔点琼脂糖凝胶电泳法低熔点琼脂糖凝胶电泳法首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的片段，分离目的条带条带DNA，然后，然后紫外光紫外光下切割含目的下切割含目的DNA条带的胶条带的胶块，利用块，利用胶回收试剂盒胶回收试剂盒回收纯化回收纯化DNA片段。片段。试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一

20、定的高盐缓试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效专一地吸附冲系统下高效专一地吸附DNA、RNA的原理，配备的原理，配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，在几分钟之内即可以高效回收核酸片段。心机，在几分钟之内即可以高效回收核酸片段。1）切胶，放入）切胶，放入1.5ml离心管中；离心管中；2） 加入溶胶液，置加入溶胶液，置55水浴水浴10分钟，分钟，使琼脂糖块完全溶化；使琼脂糖块完全溶化；3）琼脂糖液移入吸附柱，）琼脂糖液移入吸附柱，12000 rpm 室温离心室温离心1分钟，倒掉收集管中分钟，倒掉收集管中的液体

21、；的液体；4）在吸附柱中加入漂洗液，室温静）在吸附柱中加入漂洗液，室温静置置1分钟后，分钟后， 12000rpm 室温离心室温离心30秒，倒掉收集管中的液体；秒，倒掉收集管中的液体；5）重复漂洗一次；）重复漂洗一次；6） 12000rpm 室温空离心室温空离心1分钟；分钟；7）将吸附柱放入一个）将吸附柱放入一个干净的干净的1.5ml的的离心管离心管中，在吸附膜中央加入中，在吸附膜中央加入30ul洗洗脱缓冲液，室温静置脱缓冲液，室温静置2分钟后，分钟后， 12000rpm 室温离心室温离心1分钟；分钟；8）琼脂糖凝胶电泳检测回收产物；）琼脂糖凝胶电泳检测回收产物；凝胶纯化结果示意图透析袋电洗脱法

22、透析袋电洗脱法 适用于适用于小剂量小剂量DNA纯化和酶切纯化和酶切DNA片段回收。片段回收。步骤：步骤：电泳分带。电泳分带。切胶，装入透析袋，进行电泳切胶，装入透析袋，进行电泳1-2h后，再反向电泳后，再反向电泳1-2min。洗脱液离心。洗脱液离心。转移，加入转移，加入2倍体积无水乙醇混匀，于倍体积无水乙醇混匀，于-20放置过夜放置过夜沉淀后，离心后去除上清液，最后把沉淀物溶于沉淀后，离心后去除上清液，最后把沉淀物溶于TE缓冲液中，缓冲液中，-20保存备用。保存备用。 通过凝胶电泳回收的通过凝胶电泳回收的DNA样品，因检测需要样品，因检测需要而含有而含有溴化乙锭溴化乙锭(EB)，会，会影响限制

23、性核酸内切影响限制性核酸内切酶的切割酶的切割，因此有必要去掉插入到，因此有必要去掉插入到DNA中的中的EB，常采用的方法有：，常采用的方法有：正丁醇正丁醇(或异戊醇或异戊醇)抽提抽提或或Dowex(道埃克斯道埃克斯)树脂层析法等。树脂层析法等。DNA的浓缩的浓缩 当提取的当提取的DNA溶液的浓度达不到实验要求时，溶液的浓度达不到实验要求时，必须进行必须进行DNA溶液的浓缩。实验室常用的方法溶液的浓缩。实验室常用的方法有：有： 乙醇沉淀法、乙醇沉淀法、 正丁醇抽提法和聚乙二醇正丁醇抽提法和聚乙二醇浓缩法等。浓缩法等。 乙醇沉淀乙醇沉淀 DNA不溶于乙醇，因此可用乙醇来沉淀不溶于乙醇，因此可用乙醇

24、来沉淀DNA以达到纯化以达到纯化DNA的目的。乙醇沉淀是浓缩的目的。乙醇沉淀是浓缩DNA的的常用方法。常用方法。1、按、按DNA溶液量的溶液量的1/10体积加入体积加入3mmol/L NaAc。2、加、加2.5倍体积的预冷倍体积的预冷100%乙醇，盖上盖子混匀。乙醇，盖上盖子混匀。3、-70静置静置15min，或，或-20 静置静置1h以上。以上。4、4 、15000r/min，离心，离心15min，沉淀，沉淀DNA。5、弃上清。、弃上清。6、加、加70%乙醇适量，漂洗沉淀，再次离心。乙醇适量，漂洗沉淀，再次离心。7、干燥、干燥1030min。8、加、加TE溶解。溶解。盐能中和核酸上的电荷，因

25、此盐能中和核酸上的电荷，因此易使易使DNA沉淀，但加入过多易沉淀，但加入过多易产生盐析。产生盐析。（四）（四）DNA的定量和纯度测定的定量和纯度测定 DNA样品的浓度的测定，一般采用样品的浓度的测定，一般采用紫外光谱分析、紫外光谱分析、EB荧光分析荧光分析、水平式琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰、水平式琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和脉冲电泳法等。胺凝胶电泳法和脉冲电泳法等。 紫外光谱分析法紫外光谱分析法 紫外光谱分析法的原理基于紫外光谱分析法的原理基于DNA(或或RNA)分子在分子在260nmm处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统中统中DNA或或RNA的浓

26、度成正比。的浓度成正比。分子形状、双分子形状、双链与单链链与单链之间的转换也会导致吸收水平的改变，之间的转换也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用特定的公式来校正。该法但是这种偏差可以用特定的公式来校正。该法的特点是的特点是准确、简便，但所需仪器较昂贵。准确、简便，但所需仪器较昂贵。衡量所提取衡量所提取DNA的纯度可用的纯度可用OD260与与OD280的比值表示，的比值表示，OD260/OD280对对DNA而言其值大约为而言其值大约为1.8。当当OD260/OD280大大于于1.8则可能有则可能有RNA污染污染。当当OD260/ OD280小于小于1.8时则有时则有蛋白质污染蛋白质污染。双

27、链双链DNA的的OD260为为 1时相当于浓度为时相当于浓度为50g/mL。单链单链DNA的的OD260为为 1时相当于浓度为时相当于浓度为40g/mL。寡核酸的寡核酸的OD260为为 1时相当于浓度为时相当于浓度为20-40g/mL。EB荧光分析法荧光分析法 由于结合于由于结合于DNA分子之上的分子之上的EB的量与的量与DNA分子分子长长度和数量度和数量成正比，则荧光强度可以表示成正比，则荧光强度可以表示DNA量量的多少。的多少。EB是嫌疑性的致突变物质。是嫌疑性的致突变物质。第二节第二节 RNA的分离、检测和纯化的分离、检测和纯化细胞中的核酸：细胞中的核酸：DNA和和RNA。RNA：rRN

28、A、 tRNA、 mRNA 。 80%85% rRNA(28S、18S、5S rRNA)。 15%20%低分子量低分子量RNA(如如tRNA、核内小、核内小分子分子RNA等）。等）。 1%5% mRNA，一般按，一般按2%计算。计算。Trizol法提取细胞总法提取细胞总RNA RNA实验失败的主要原因是实验失败的主要原因是RNA酶的污染酶的污染。由于由于RNA酶酶广泛存在而稳定广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会引起酶就会引起RNA的降解，而所制备的的降解，而所制备的RNA的的纯度

29、和纯度和完整性完整性又可直接影响又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一分析的结果，所以建立一个无个无RNA酶的环境对于制备酶的环境对于制备RNA很重要。很重要。常用的常用的RNA酶抑制剂：酶抑制剂：焦磷酸二乙酯（焦磷酸二乙酯（DEPC）：与）：与RNA酶的活性基团组酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，有高致癌性。（实验准备阶段氨酸的咪唑环结合，有高致癌性。（实验准备阶段使用）使用）异硫氰酸胍、氯仿：提取异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使同时也使RNA酶失活。酶失活。1. RNA酶的蛋白抑制剂（酶的蛋白抑制剂（RNasin）：酸性糖蛋白。）：酸性糖蛋白。（合成（合成cDNA阶段使用）阶段使用）

30、1.在实验室最好有专门的在实验室最好有专门的RNA操作区，离心机、操作区，离心机、移液器、试剂等专用。移液器、试剂等专用。RNA操作区应保持清洁操作区应保持清洁，并定期进行除菌。，并定期进行除菌。 2.相关耗材相关耗材(Ep管、管、Tip头头)应先用应先用0.1% DEPC水浸水浸泡过夜并高压消毒。也可直接使用厂家供应的泡过夜并高压消毒。也可直接使用厂家供应的无无RNase的的Ep管、管、Tip头。头。 3.金属器械和玻璃器皿应在使用前于金属器械和玻璃器皿应在使用前于180的高温的高温下干烤下干烤6hr或更长时间。或更长时间。注意事项注意事项4.塑料器皿可用塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡

31、或用氯仿冲洗水浸泡或用氯仿冲洗5.配制的溶液应尽可能加入配制的溶液应尽可能加入DEPC至终浓度至终浓度0.1%处处理理12hr以上，然后用高压灭菌除去残留的以上，然后用高压灭菌除去残留的DEPC。（不能用。（不能用DEPC或高压灭菌的试剂，如或高压灭菌的试剂，如Tris、DTT等，应当用等，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制处理过的无菌双蒸水配制，然后经，然后经0.22m滤膜过滤除菌）滤膜过滤除菌）6.人的唾液和汗液含有人的唾液和汗液含有RNA酶，故在操作中应戴手酶，故在操作中应戴手套，避免讲话。套，避免讲话。Trizol是一种是一种苯酚苯酚与与异硫氰酸胍异硫氰酸胍(GTC)的混合物的混合物

32、，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。与蛋白质分离。酸性酸性苯酚苯酚促使促使RNA进入水相，加入氯仿可抽提进入水相，加入氯仿可抽提酸性的苯酚，离心后，酸性的苯酚，离心后，RNA保留在水相中，保留在水相中，DNA和和蛋白质保留在有机相中。蛋白质保留在有机相中。水相加入异丙醇沉淀水相加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总，从而得到纯化的总RNA。nTrizol法提取原理法提取原理真核生物真核生物mRNA的纯化的纯化（1）寡聚）寡聚(dT)亲和层析柱分离亲和层析柱分离mRNA（2）磁性分离技术纯化）磁性分离技术纯化mRNA（1

33、）寡聚）寡聚(dT)亲和层析柱分离亲和层析柱分离mRNA利用利用mRNA 3末端含有末端含有Poly（A+）的特点，在的特点，在RNA流经流经寡聚（寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即）纤维柱后，即可得到较高纯度的可得到较高纯度的mRNA磁性分离技术纯化磁性分离技术纯化mRNA先将连有生物素的先将连有生物素的oligo(dT)引物与引物

34、与mRNA3-端的端的polyA一起杂交；一起杂交；加入连有生物素结合蛋白的磁球，使杂交体与磁球加入连有生物素结合蛋白的磁球，使杂交体与磁球结合；结合；通过磁场作用，使连有杂交体的磁球与其他通过磁场作用，使连有杂交体的磁球与其他RNA分分离；离；通过洗脱将连在磁球上的通过洗脱将连在磁球上的mRNA洗脱下来而得到纯洗脱下来而得到纯化的化的mRNA。该方法简单、迅速、不易引起该方法简单、迅速、不易引起mRNA的降解。的降解。RNA的电泳检测RNA的浓度和纯度可通过测的浓度和纯度可通过测试其试其OD260来判断，来判断， OD260为为 1时相当于浓度为时相当于浓度为40g/mLg/mL。检测：检测

35、：琼脂糖凝胶电泳法、聚琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法。丙烯酰胺凝胶电泳法。28S18S总RNA电泳条带第三节第三节 分子杂交分子杂交 一一、SouthernSouthern杂交杂交二二、NorthernNorthern杂交杂交三三、菌落原位杂交菌落原位杂交四四、WesternWestern杂交杂交分子杂交分子杂交 (molecule hybridization)分子杂交分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用已知标记的核酸分子或蛋白质分析方法，用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或

36、蛋白质分子，以及其相对分子量大小。质分子，以及其相对分子量大小。根据其根据其检测对象检测对象的不同可分为的不同可分为 Southern 杂交、杂交、Northern 杂交和杂交和 Western 杂交杂交 ，及由此简及由此简化的化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交。斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交。 分子杂交可在分子杂交可在DNA与与DNA、RNA与与RNA或或RNA与与DNA的二条单链之间进行的二条单链之间进行，也可能在蛋白质，也可能在蛋白质与蛋白质之间进行。与蛋白质之间进行。 核酸分子杂交是指核酸分子核酸分子杂交是指核酸分子(DNA或或RNA)在在变变性性以后，在以后，在复性复性的过程中两个的过程

37、中两个不同来源的且同源的不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程。核酸分子形成杂合双链的过程。通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的显影后显示出目的DNA或或RNA分子所处的位置。分子所处的位置。 一、一、SouthernSouthern杂交杂交 这种方法是这种方法是E.M.Southern1975E.M.Southern1975年建立年建立, ,是进是进行基因组行基因组DNADNA特定序列定位的通用方法。特定序列定位的通用方法。（一）（一）

38、SouthernSouthern杂交的操作步骤杂交的操作步骤1.1.预处理：预处理： （1 1）用限制性内切酶将基因组）用限制性内切酶将基因组DNADNA进行进行酶切酶切。 （2 2）将酶切后的）将酶切后的DNADNA片段进行琼脂糖凝胶片段进行琼脂糖凝胶电泳电泳。 （3 3）凝胶泡在）凝胶泡在强碱溶液强碱溶液中，双链的中，双链的DNADNA样品样品变性变性。 （4 4）用酸）用酸中和中和，使单链，使单链DNADNA维持其单链状态维持其单链状态2.2.原位转移：原位转移： 将凝胶上的将凝胶上的单链单链DNADNA转移到尼龙膜转移到尼龙膜上。上。3.3.固定：固定： 在真空烤箱里，在真空烤箱里，8

39、080下烤下烤1-3h1-3h。将核酸样品进。将核酸样品进一步一步固定固定在滤膜上在滤膜上4.4.杂交：杂交：杂交之前须有一个杂交之前须有一个预杂交预杂交，封阻膜的背景，避免杂交，封阻膜的背景，避免杂交时背景吸附探针。时背景吸附探针。封闭试剂成分主要是大量的非同封闭试剂成分主要是大量的非同源性的核酸或蛋白质等。源性的核酸或蛋白质等。将滤膜移入含有放射性同位素标记的将滤膜移入含有放射性同位素标记的探针探针分子溶液中，分子溶液中，滤膜上的单链滤膜上的单链DNADNA分子与探针分子通过互补配对进分子与探针分子通过互补配对进行行杂交杂交，形成杂种分子。，形成杂种分子。 5.漂洗：漂洗： 将滤膜上没有和

40、单链将滤膜上没有和单链DNA样品结合的游离的探针样品结合的游离的探针分子漂洗下来。分子漂洗下来。6.放射自显影：放射自显影： 在在X光曝射下进行放射自显影形成自显影图片。光曝射下进行放射自显影形成自显影图片。7.比较鉴定：比较鉴定： 将放射自显影图片上的谱带与凝胶上的谱带进行比将放射自显影图片上的谱带与凝胶上的谱带进行比较。确定与探针分子结合的较。确定与探针分子结合的DNA分子是凝胶上分子是凝胶上DNA链的那个片段。链的那个片段。1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA2.通过毛细管渗析法转移胶中的通过毛细管渗析法转移胶中的DNA3.固定胶中的固定胶中的DNA4.预杂

41、交和杂交预杂交和杂交(放射性和荧光检测放射性和荧光检测)5.结果检测，比较鉴定。结果检测，比较鉴定。（一）（一）SouthernSouthern杂交的操作步骤杂交的操作步骤 Southern Southern印迹杂交方法印迹杂交方法操作简单，结果十分灵敏。操作简单，结果十分灵敏。在理想的条件下，应用放射性同位素标记的特异性探在理想的条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即使每带电泳条带仅含有针和放射自显影技术，即使每带电泳条带仅含有2ng2ng的的DNADNA也能被清晰地检测出来。也能被清晰地检测出来。 1.硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜 在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应

42、用最广的一在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应用最广的一种固相支持物，但它存在一些不足之处种固相支持物，但它存在一些不足之处: （1）硝酸纤维素滤膜是依赖）硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用疏水性相互作用结合结合DNA的，这种结合并不十分牢固。的，这种结合并不十分牢固。（二）（二）Southern杂交的杂交滤膜杂交的杂交滤膜（2）硝酸纤维素滤膜）硝酸纤维素滤膜质地较脆弱质地较脆弱，容易碎裂。，容易碎裂。（3）硝酸纤维素滤膜与核酸的结合）硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐有赖于高盐浓度浓度。（4）硝酸纤维素滤膜对于）硝酸纤维素滤膜对于小分子质量小分子质量的的DNA片片段段 (特别是小于特别是小

43、于200bp的的DNA片段片段)结合能力结合能力不不强强。2. 尼龙膜尼龙膜优点：优点：结合结合DNA和和RNA的能力的能力强于强于硝酸纤维素滤膜，对小硝酸纤维素滤膜，对小分子质量的核酸也能较好地结合。分子质量的核酸也能较好地结合。尼龙膜韧性强，操作较方便，对离子浓度要求不高，尼龙膜韧性强，操作较方便，对离子浓度要求不高，可重复用于杂交。可重复用于杂交。缺点：缺点：杂交信号杂交信号本底本底较硝酸纤维素滤膜较硝酸纤维素滤膜高高。将将RNA分子分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。行核酸

44、杂交的一种实验方法。二、二、 Northern杂交杂交 Northern杂交的过程杂交的过程 提取总提取总RNA。 分离分离mRNA。利用亲和层析的原理纯化利用亲和层析的原理纯化mRNA。 制备制备RNA探针。探针。根据根据mRNA序列合成同源序列合成同源DNA探针，或以探针，或以cDNA为探针。为探针。 Northern杂交。杂交。Northern杂交的方法包括点杂杂交的方法包括点杂交和印迹杂交，两者都能鉴定外源基因是否得到交和印迹杂交，两者都能鉴定外源基因是否得到转录，但后者还能确定转录，但后者还能确定mRNA分子质量大小及丰分子质量大小及丰度。度。三三 菌落原位杂交菌落原位杂交 （col

45、ony in situ hybridization）直接把直接把菌落印迹菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上，经转移到硝酸纤维素滤膜上，经溶菌和变性溶菌和变性处理后使处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结暴露出来并与滤膜原位结合，再与特异性合，再与特异性DNA探针杂交，筛选出含有插入序探针杂交，筛选出含有插入序列的菌落。列的菌落。菌落原位杂交的操作步骤菌落原位杂交的操作步骤 四四 Western杂交杂交是将是将蛋白质电泳、印迹和免疫测定蛋白质电泳、印迹和免疫测定结合在一起的检测结合在一起的检测方法，具有很高的灵敏度（方法，具有很高的灵敏度（50 ng）。）。原理：原理：先从生物细胞中先从生物细胞中提取

46、提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有样品溶解于含有去污剂和还原剂去污剂和还原剂的溶液中的溶液中经经SDS-PAGE电泳电泳将蛋白质按分子量大小分离，再将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带把分离的各蛋白质条带原位转移原位转移到固相膜（硝酸纤到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上维素膜或尼龙膜）上接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其封闭其非特异性位点非特异性位点然后加入特异抗性体（然后加入特异抗性体（一抗一抗），膜上的目的蛋白（抗原），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合）与一抗结合再加入能与一抗专一性结合

47、的带标记的再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗二抗（通常一抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体）用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体）最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。 Step 1. Antibody Recognitionof target protein

48、/antigenStep 2. Secondary Antibodyrecognition of primary AbStep 3. Color DevelopmentWestern杂交的操作步骤杂交的操作步骤 总结总结 Southern印迹法（印迹法（DNA印迹法印迹法,Southern blotting）：）：是一种把是一种把DNA电泳分离区带转移到支持膜上的技术。电泳分离区带转移到支持膜上的技术。 Northern印迹法（印迹法（RNA印迹法印迹法,Northern blotting）：）：Alwine等人将等人将Southern印迹法印迹法应用于应用于RNA，原理与，原理与Southe

49、rn印迹法相似。印迹法相似。 Western印迹法（蛋白质印迹法，印迹法（蛋白质印迹法，Western blotting）：）：是一种从混合蛋白质中检出微量特是一种从混合蛋白质中检出微量特定蛋白质的方法。定蛋白质的方法。 Eastern印迹法（印迹法（Eastern blotting）：）：也是一种也是一种蛋白质印迹法蛋白质印迹法，与，与Western印迹法印迹法不同之处不同之处是：是：先用先用等电聚焦等电聚焦-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF-PAGE）分离蛋白质，然后也是将蛋白质的分离区带、以分离蛋白质，然后也是将蛋白质的分离区带、以电驱动转移方式进行了印迹。电驱动转移方式进行

50、了印迹。一、一、RNARNA的的S1S1核酸酶作图：分析原核酸酶作图：分析原mRNAmRNA加工剪加工剪接为成熟接为成熟mRNAmRNA中的剪切区段和边界。中的剪切区段和边界。二、二、S1S1核酸酶作图分析核酸酶作图分析mRNAmRNA端点：端点：5 5和和3 3端端均可分析。均可分析。三、引物延伸法分析三、引物延伸法分析mRNAmRNA的端点：只能用于的端点：只能用于5 5末端的作图。末端的作图。第四节 RNARNA作图和端点分析作图和端点分析( (自学自学) )RNA的的S1核酸酶作图核酸酶作图分析分析mRNA端点端点引物延伸法分析引物延伸法分析mRNA的端点的端点第五节第五节 重组重组D

51、NA分子导入受体细胞分子导入受体细胞一一 选择受体细胞的基本原则选择受体细胞的基本原则二二 重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌转化大肠杆菌基本概念基本概念 受体细胞受体细胞(receptor cell) 又称为宿主细胞或寄主细胞又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等，能摄取外等，能摄取外源源DNA并使其稳定维持的细胞并使其稳定维持的细胞。 感受态感受态(competence) 细胞处于能够细胞处于能够吸收吸收DNA的状态，称为感受态。的状态，称为感受态。 感受态细胞感受态细胞(competent cell) 处于能够吸收处于能够吸收DNA状态的细胞。状态的细胞。 细菌转化，细菌转化，

52、是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。的生命过程。 转化子转化子(transformant)：经转化获得外源遗传物质经转化获得外源遗传物质的细胞。的细胞。 转化转化(transformation):指将指将质粒质粒DNA或以它为或以它为载体构建的重组质粒导入细菌中的过程。载体构建的重组质粒导入细菌中的过程。 转染转染(transfection):指指病毒病毒及其重组子导入受及其重组子导入受体细胞的过程。体细胞的过程。 转导转导(transduction):指指噬菌体噬菌体及其重组子导入