人剪切修复基因XPD对肝癌细胞生长的抑制作用

1、人剪切修复基因 XPD 对肝癌细胞生长的抑制作用作者：黄神安，徐江晶，张吉翔，熊瑛，尹东，李军作者单位：1.330006 南昌大学第二附属医院消化内科；2.江西省分子医学重点实验室【摘要】【摘要】目的探讨野生型人剪切修复基因着色性干皮病基因 D(xerodermapigmentosum D,XPD)对肝癌细胞 SMMC7721 增殖的影响，并探讨其机制。方法用脂质体转染法瞬时转染 SMMC7721 细胞，转染重组质粒 XPDN2 和空载质粒N2，并用未转染的与 XPDN2、N2 具有相同遗传背景和代数的 SMMC7721 细胞作为空白对照。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况，流式细胞仪

2、检测细胞周期，逆转录聚合酶链反应（RTPCR）、Western blot 法检测细胞中 XPD、cmyc、cdc25A、cdK2 表达量变化，MTT 法观察细胞增殖的活力。结果提取出的重组质粒 pEGFPN2XPD 用酶切鉴定，与 Genebank 上的相符。在荧光显微镜下，可以在 SMMC7721pEGFPN2、SMMC7721pEGFPN2XPD 细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达，质粒的转染效率为 30%左右。流式细胞仪结果显示，pEGFPN2XPD 重组质粒转染入细胞后，肝癌细胞进入 S 期发生阻滞，停滞在 G1 期。RTPCR、Western blot 检测发现 SMMC7721pEGF

3、PN2XPD 细胞与 SMMC7721pEGFPN2 和SMMC7721 两对照组相比，其 XPD 表达明显增高（P0.05）。cmyc、cdc25A、cdK2 相对表达量明显减少，差异有统计学意义（P0.05）。与两对照组相比，SMMC7721pEGFPN2XPD 细胞增殖率明显减弱（P0.05）。结论野生型 XPD 基因可以在转录和翻译水平抑制SMMC7721 细胞内 cmyc、cdc25A、cdK2 的表达。而且野生型 XPD 基因通过抑制 cdK2 的表达作用于 S 期 DNA 损伤检控点，从而抑制 SMMC7721 细胞增殖。【关键词】【关键词】肝癌； XPD；cmyc；cdc25A

4、；cdK2；DNA 损伤检控点Xeroderma Pigmentosum D Gene InhibitsProliferation of HumanHepatocellular Carcinoma Cell Line SMMC7721HUANG Shenan1, XU Jiangjing2, ZHANG Jixiang1,2, XIONGYing1, YIN Dong2, LI Jun11Department of Gastroenterology, The Second AffiliatedHospital of Nanchang University, Nanchang, Jiangxi

5、330006, China；2Jiangxi Provincial Key Laboratory of Molecular MedicineCorresponding Author:ZHANG Jixiang,Email:Abstract：Objective The Xeroderma Pigmentosum D (XPD)gene plays an important role in the path to DNA repair. It has beenreported that cells obtained high tumorsusceptibility whenmutation hap

6、pened in XPD gene. The purpose of this study is toinvestigate the influence of XPD gene in the growthandproliferation of hepatoma carcinoma cells (HCC).MethodspEGFPN2 andpEGFPN2XPD were transfected into SMMC7721 cell lines byLipofectamine2000 method. The expression of green fluorescent protein(GFP)

7、was observed through fluorescence microscope. Cell cycle of theplasmidtransfected SMMC7721 cells was analyzed by Flow cytometry(FCM). The expressions of wildtype XPD, cmyc, cdc25A and cdK2were detected by RTPCR and Western blot. Cell proliferation wasmeasured by MTT assay.ResultsThe recombinant plas

8、mid pEGFPN2XPDwas successfully transfected into SMMC7721 cells and greenfluorescence in cells was observed by fluorescent microscopy. Around30% transfection efficiency was obtained in this experiment. Inaddition, we have found that wild type XPD blocked the hepatoma cellsfrom S stage to G1 stage The

9、 expression of XPD inSMMC7721pEGFPN2XPD cells was significantly higher than thosein control group of SMMC7721 and SMMC7721pEGFPN2 cells(P0.05). The expressions of cmyc, cdc25A and cdK2 inSMMC7721pEGFN2XPD cells were significantly lower than thosein control cells (all P0.05). Furthermore,SMMC7721pEGF

10、PN2XPD has reduced proliferation ability thanempty plasmidtransfected cells (P0.05).ConclusionWildtype XPDdownregulated the expression of cmyc, cdc25A, and cdK2. Our resultssuggested that XPD inhibit the proliferation of SMMC7721 cellsprobably due to the blockage at S period DNA damage checkpoint in

11、hepatocellular carcinoma cell cycle.Key words：Liver cancer; XPD; CMyc; Cdc25A; CdK2; DNA damagecheckpoint1 1 材料和方法材料和方法1.1 材料1.1.1 细胞株和质粒来源人肝癌细胞 SMMC7721 购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。重组质粒 pEGFPN2XPD 本实验室构建。1.1.2 主要试剂和产地 RPMI1640 购自美国 Gibco BRL 公司。胎牛血清（FBS）购自南非 Hyclone 公司。Trypsin、Monoclonal Antibody Againsta

12、ctin 购自美国 Sigma 公司。Lipofectamine2000TM、TrizolTM 试剂购自美国 Invetrogen 公司。Wazard PureFection Plasmid DNA PufiicationSystem、MMLV Reverse Transcriptase、RNasin、dNTP、Oligo(dT)15 购自美国 Promega 公司。DMSO、DEPC 购自美国 Amresco 公司。PCR 引物购自上海生物工程技术服务有限公司。Taq 酶购自日本 TaKaRa 公司。DNA 2000 LadderMarker 购自北京华美生物工程公司。MTT 购自上海普飞生

13、物技术有限公司。单克隆抗体 XPD、cmyc、cdc25A 和 cdK2 购自美国 Santa Cruz 公司。山羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶、山羊抗兔 IgG辣根过氧化物酶购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养 SMMC7721 细胞在含 15% FBS 的 RPMI1640 培养基中，37、5%CO2 的条件下孵箱（Forma Scientific Inc,USA）中培养，以0.25%胰蛋白酶消化，23 天传代一次。1.2.2 质粒鉴定用碱裂解法提取空载质粒 pEGFPN2 和重组质粒pEGFPN2XPD，提取出的质粒以 KPN、BGI和 SPH酶切鉴定。1.2.

14、3 质粒转染实验设 3 组，每组 2 孔，分别为无转染空白对照组（SMMC7721），空载质粒转染细胞组（SMMC7721pEGFPN2）以及重组质粒转染细胞组(SMMC7721pEGFPN2XPD)。以 2105 个细胞/孔的密度将SMMC7721 细胞铺于 6 孔板内，24h 细胞铺 90%，pEGFPN2、pEGFPN2XPD每孔 0.4g，脂质体每孔 10l 介导转染。转染 6h 后换有血清的培养基在37、5%CO2 的条件下孵育。40h 后在荧光显微镜下观察，荧光显微镜激发光波长 395nm，观察 pEGFP 释放波长为 508nm 的绿色荧光。1.2.4 流式细胞仪（重复 3 次）

15、用胰酶消化收集上述各组转染后的细胞，应用 FACSCalibar 流式细胞仪（Beckton Dickinson 公司，USA）分析，氩离子激光器激发波长为 488nm，在流式细胞仪上进行细胞周期分析，得出细胞各周期的百分率。1.2.5RTPCR 测定基因表达量使用 Trizol 试剂提取各组细胞总 RNA，按照 SuperstcriptTM 试剂盒说明合成 cDNA。使用核酸蛋白分析仪（Eppendof公司,German）测定总 RNA 以及 cDNA 浓度。根据 GenBank 中公布的人类 XPDmRNA 序列，人类 cmyc mRNA 序列、人类 cdc25A mRNA 序列，人类 c

16、dK2 mRNA序列，以及人类actin mRNA 序列设计引物。XPD 正义：5GCCCGCTCTGGATTATACG3，反义：5CTATCATCTCCTGGCCCCC3，扩增片段长度 436bp；cmyc 正义：5AACCCTTGCCGCATCCAC3，反义：5CCTCCTCGTCGCAGTAGAAA3，扩增片段长度 317bp；cdc25A 正义：5TGATGAGGATGATGGCTTCG3，反义：5CTGCACCCTTGATGTGGC3，扩增片段长度 562bp；cdK2 正义：5ACTGGCATTCCTCTTCCC3，反义：5CTGGCTTGGTCACATCCTG3，扩增片段长度 5

17、89bp；actin 正义：5CTTCCTGGGCATGGAGTC3，反义：5GCCGATCCACACGGAGTA3，扩增片段长度 232bp。6l PCR 扩增产物经 1.5%琼脂糖（含溴乙锭 5g/ml）电泳，通过 FR200 图像分析软件（上海复日公司）读取目的电泳条带的斑点密度扫描值，以各组actin 条带的扫描值标化其相应组的 XPD、cmyc、cdc25A、cdK2 条带的密度扫描值，获得其相对表达量，并进行统计学分析。1.2.6MTT 法（重复 4 次）在 96 孔板中进行 3 组细胞的转染，每组 6孔，每孔 1103 个细胞，对照组只加培养基，转染后培养 40h，每孔加入5mg

18、/ml MTT 10l，继续培养 4h，弃上清，加入 100l DMSO，振荡 10min，酶标仪（Labststems,芬兰）测定 492nm 处各孔吸光度（A）值，取每孔平均值。计算细胞抑制率，细胞抑制率=(1-A 实验组A 对照组)100%。1.2.7 蛋白表达检测（Western blot）使用蛋白抽提液分别提取三组细胞的总蛋白，使用全自动生化分析仪（Beckman,USA）测定蛋白浓度。取同量蛋白上样于 8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，继而转移蛋白于硝酸纤维素膜；将膜置于含 5%脱脂奶粉的 TBST 中 4封闭过夜，加封闭液稀释的一抗(1200)过夜，用 TBST 洗膜 315min，加

19、封闭液稀释 HRP 标记二抗（12000），4过夜，TBST 洗膜 330min，显色。1.3 统计学方法 数据以s 表示，方差齐使用卡方检验，方差不齐使用秩和检验，并应用 SPSS11.5 统计软件进行分析。2 2 结果结果2.1pEGFPN2XPD 质粒鉴定重组质粒经 KPN和 BGI双酶切后电泳应在 4737bp 位置和约 2300bp 位置各有一条带。此外，限制性核酸内切酶SPH在 pEGFPN2 纯质粒的 2332、2404、3167bp 位置和 XPD 的 636bp 位置各有一酶切位点，同时我们的 XPD 是在 pEGFPN2 质粒的 612bp 和 652bp 之间以正义方向插

20、入，所以重组质粒经 SPH单酶切后电泳应包括 2818、3344、763和 72bp 四条带。与 Genebank 中公布的人类 XPD 完整 mRNA 序列 NM_000400.2 相符合,见图 1。2.2pEGFPN2XPD 转染成功鉴定 pEGFPN2 载体在其多克隆位点后带有绿色荧光蛋白报告基因。通过脂质体转染方式将 pEGFPN2 和 pEGFPN2XPD重组质粒转染入 SMMC7721 细胞 40h 后，在荧光显微镜下观察到了细胞中绿色荧光蛋白的表达，见图 2。未转染质粒的纯 SMMC7721 细胞则没有。通过激光共聚焦显微镜观察 pEGFPN2XPD 的转染效率，转染后 40h，

21、转染效率为 30%左右。2.3pEGFPN2XPD 重组质粒对 SMMC7721 细胞周期的影响SMMC7721pEGFPN2XPD 重组质粒转染细胞组与两对照组相比 G1 期细胞明显增多，S 期细胞明显减少，差异均有统计学意义（P0.05）。SMMC7721pEGFPN2 空质粒转染细胞组与 SMMC7721 细胞组 G1、S 期差异无统计学意义,见表 1。因此 SMMC7721pEGFPN2XPD 重组质粒转染细胞进入 S 期出现障碍，停滞在 G1 期的细胞增多。表 1 流式细胞仪分析各组细胞细胞周期情况2.4 三组细胞内 XPD、cmyc、cdc25A、cdK2 mRNAs 的表达情况2

22、.5 三组细胞内 XPD、cmyc、cdc25A、cdK2 蛋白的表达情况转染野生型XPD 后，SMMC7721 细胞内 XPD 表达明显增高,cmyc、cdc25A、cdK2 表达明显下降（P0.05），见图 4。2.6pEGFPN2XPD 重组质粒对 SMMC7721 细胞增殖活力的影响重组质粒转染组 SMMC7721XPD 细胞增殖有了明显变化，与空质粒 N2 转染组细胞SMMC7721pEGFPN2 和空白对照组细胞 SMMC7721 相比，SMMC7721XPD 细胞增殖明显减少。SMMC7721pEGFPN2XPD 细胞组相对于 SMMC7721 细胞组抑制率为 50%（P0.05

23、）；SMMC7721pEGFPN2 细胞组相对于 SMMC7721 细胞组抑制率为 5%（P=0.45）。这说明 XPD 基因降低了 SMMC7721 细胞代谢，抑制了 SMMC7721 细胞的增殖。3 3 讨论讨论近年来的研究发现，哺乳动物基本转录因子H (TFH)特别是 XPD 参与了核酸切除修复（NER）。研究者指出，XPD 基因发生突变时，肿瘤易感性更高2。我们把野生型 XPD 基因转染入肝癌细胞中，发现肝癌细胞中的 cmyc、cdc25A、cdK2 基因在转录和翻译水平表达量明显减少；细胞周期停滞在 G1期，不能进入 S 期；肝癌细胞增殖明显受到抑制。肝癌中 cmyc 表达常过量，本

24、实验组已证实野生型的 TFH 之一 XPB 可以抑制 cmyc 表达3。XPD 可以通过 Fuse 结合蛋白（FBP）影响 cmyc 的表达；FBP 有潜在的转录活化和抑制功能，是 cmyc 表达所必需的；FBP 干扰抑制子（FIR）可通过 TFH 阻断转录，而 FBP 可结合 cmyc 基因的单链上游活化元件（FUSE）来抑制 cmyc 表达4。当 XPD 发生突变时，突变型 XPD 可以阻断 FUSE 结合蛋白（FBP）的活化，而后者的活化可以使 cmyc 表达下降，当 XPD 发生缺陷或突变时 cmyc表达量常增加；将 FBP 或/与 XPD 转入进 XPD 缺陷的细胞后 cmyc 表达

25、量可下降5。cdc25A 在多种肿瘤中如结肠癌、乳腺癌、肝癌6等均有过度表达，并且与患者预后有关，cdc25A 被认为是一种癌基因，分别在 G1/S 期和 G1 期中发挥作用。cdc25A 过度表达可导致细胞生长失控后恶化。cdc25A 是 cmyc 的靶基因之一7。本实验在 SMMC7721 细胞中转染 XPD 后，细胞中癌基因cmyc、cdc25A 表达量均下降，野生型 XPD 抑制了 cmyc、cdc25A 基因的表达。癌基因表达下降，可引起癌细胞的生长力降低。cdK2 是 S 期的关键性激酶，在进入 S 期和 DNA 复制过程中发挥其引擎作用8。在 DNA 复制过程中如果遇到 DNA

26、损伤，被激活的 Chk1 磷酸化 cdc25A，cdc25A 能够去除 cdK2 上的抑制性磷酸根。这样抑制了 cdc25A 最终抑制了 cdK2 的活性，从而抑制了尚未起始的 DNA 复制起始点的发动。cdc25A、cdK2 基因都是与细胞周期密切相关的基因。在细胞周期进程中，G1 期是个重要的调控点，它决定细胞是否通过 G1期，进入 S 期，从而进行细胞增殖，因此 G1/S 转换的调控机制成为肿瘤研究的热点，细胞周期 G1 期和 G1/S 转换期各调节因子的异常改变与细胞癌变关系尤为密切9。我们的流式细胞仪分析结果指出：XPD 基因转入肝癌细胞后，细胞停滞在 G1 期，进入 S 期发生障碍

27、。表明 XPD 基因可以使癌细胞停滞在 G1 期，从而使癌细胞增殖大幅度减少，MTT 结果也证实了这一结论。肿瘤的发生与机体 DNA 修复能力有关。细胞在长期进化过程中发展了一套能够检测 DNA 损伤、维护细胞遗传稳定性和完整性的机制，这个机制被称为 DNA 损伤检控点（DNAdamage checkpoint）。cdc25A 基因是 DNA 损伤检控点信号转导途径中的效应器。在细胞损伤修复过程中，ATM、ATR 和 Chk1、Chk2 通过限制 cdc25A 的活性和浓度，将 DNA 复制所需的 cdK2 活性保持在一个较低的水平，从而限制着 DNA复制进行的速度，防止肿瘤的形成和基因突变。

28、本实验研究结果指出 XPD 基因有可能也通过了类似的途径来抑制肝癌细胞的生长。本实验对 XPD 基因抑制肝癌细胞生长的机制作了探讨，可能的机制：(1)XPD 基因抑制癌基因 cmyc、cdC25A 基因的表达，从而抑制肝癌的增殖；(2)XPD 基因抑制 cdK2 基因的活性，从而抑制了尚未起始的 DNA 复制起始点的发动，肝癌细胞周期停滞在 G1期，使细胞进入 S 期发生障碍，细胞复制显著减少；(3)已有研究指出 XPD 基因可以激活 p5310，p53 是抑癌基因，本实验组已证实它可以抑制肝癌细胞的生长3；p53 是 DNA 损伤检控点中最关键的激活因子11，XPD 基因通过激活 p53，进

29、一步激活 DNA 损伤检控点；（4）过去的研究表明：XPD 基因发生突变时，DNA 损伤检控点受到破坏12。野生型 XPD 基因可以激活 DNA 损伤检控点，我们的实验指出 XPD 基因抑制了 cdc25A 的表达，肝癌细胞中 cdc25A 的表达量下调，从而使 cdK2 的表达更加减少，激活了 S 期 DNA 损伤检控点，XPD 基因通过 DNA 损伤检控点，防止肿瘤的形成和基因突变。我们的实验为以后 XPD基因抑制其他癌细胞生长提供了理论基础，为肝癌及其他恶性实体瘤的综合治疗提供了实验依据。但是 XPD 基因抑制肝癌生长的具体机制不是很清楚，还需要进一步的研究。【参考文献】【参考文献】1Z

30、hang L,Zhang Z,Yan W.Single nucleotide polymorphisms for DNArepair genes in breast cancer patientsJ.Clin Chim Acta，2005,359（1）:150155.2Lubinski J,Korzen M,Gorski B,et al.Breast cancer susceptibilitygenesJ.J BUON，2007，12（Suppl 1）:2329.3Hu G M,Liu L M,Zhang J X,et al.The role of XPB in cell apoptosisa

31、nd viability and its relationship with P53,P21 and cmyc inhepatoma cells J.Dig Liver Dis,2006,38(10):755761.4Liu J,He L,Collins I,et al.The FBP interacting repressor targetsTFIIH to inhibit activated transcription J.MolCell,2000,5(2):331341.5Liu J,Akoulitchev S,Weber A,et al.Defective interplay ofactivators and repressors with TFIH in xeroderma pigmentosumJ.Cell,2001,104(3):353363.6Wang Z, Wang M, Carr BI.Hepatocyte growth factor enhances proteinphosphatase Cdc25A inhibito