前列腺癌及良性前列腺增生组织中MnSOD基因的mRNA表达水平研究

1、前列腺癌及良性前列腺增生组织中MnSOD基因的mRNA表达水平研究        【摘要】     目的 分析MnSOD(SOD2)基因在前列腺癌(PCa)及良性前列腺增生(BPH)组织中的mRNA表达情况，揭示氧化应激损伤在PCa发生过程中的作用。方法 应用RTPCR法分别扩增12例PCa组织及20例BPH组织中的SOD2基因片段，半定量分析其表达情况。结果 与BPH组织相比，PCa组织中SOD2基因的mRNA表达水平显著低下(P005)。 结论 SOD2基因表达

2、低下导致氧化应激加剧在PCa的发生中可能起重要作用。     【关键词】  锰超氧化物歧化酶；前列腺癌；良性前列腺增生；基因表达；逆转录聚合酶链反应    前列腺癌(PCa) 是欧洲占第2位的常见男性恶性肿瘤,在美国则超过肺癌居首位。我国PCa发病率虽远低于西方国家，但随生活方式的改变及人口的老龄化呈显著增长趋势1。PCa发生的确切分子机制尚未阐明。近年来研究表明, 活性氧(reactive oxygen species, ROS)参与肿瘤的启动和促进过程2。SOD2基因编码含锰超氧化物歧化酶 (MnSO

3、D)，是体内主要的超氧阴离子自由基清除剂，保护细胞免受ROS的损伤。近年研究发现, SOD2的基因表达量伴随细胞的癌变过程呈正相关下降,提示SOD2基因为潜在的新型肿瘤抑制基因3，4。本实验采用RTPCR法探讨PCa及良性前列腺增生(Benign prostate hyperplasia, BPH)组织中SOD2基因的mRNA表达，以期为寻求PCa基因诊断、基因治疗的靶向基因提供基础资料。1  材料与方法11  标本的收集与处理  收集12 例PCa患者手术后的肿瘤组织标本及20例BPH患者的组织标本(标本来源于平顶山煤业集团总医院，郑州大学第一医院, 郑州大学第

4、二医院, 河南大学第二医院)。所有标本取出后立即放入无RNase的EP管中并放入液氮中保存待测。所有病人术前均未行化疗。12  方法121  总RNA的提取  从液氮中取出标本组织，加液氮在研钵中研碎, 用Qiagen公司总RNA提取试剂盒提取总RNA。122  cDNA的合成  所采用的逆转录反应体系：RTMix 9 l (5×RT缓冲液，含50 mmol/L MgCl2)6 l，10 mmol/L 4×dNTP 2 l，RNasin 40 U，AMV 2 U，通用引物1 l)，提取总RNA 5 l，DEPC水补足30 l

5、，42水浴逆转录1 h。123  PCR扩增  参照GenBank NM000636和NM001101，分别设计出SOD2和actin扩增引物，由上海生工生物公司合成，经PAGE纯化。SOD2(上游)5GTGGTGGTCATATCAATCAT 3，SOD2引物(下游)5GGCCTGTTGTTCCTTGCAGT3，扩增产物长度252 bp；内参照人actin(上游)5ACACTGTGCCCATCTACGAGG 3，actin(下游)5CTTTGCGGATGTCCACGTC 3，扩增产物长度393 bp。 扩增反应体积为30 l：逆转录所得cDNA 5 l, Mix (含有SO

6、D2引物及actin内参照引物) 6 l，Taq酶 05 l，去离子水 185 l，94预变性 5 min，94变性 50 s，55复性50 s，72延伸60 s，循环35次，72末端延伸5 min。124  扩增产物琼脂糖凝胶电泳  配制15%琼脂糖凝胶电泳(含EB 05 g/ml)，取PCR扩增产物 9 l点样电泳 ，以每cm 3 V 电泳40 min。125  半定量结果分析  使用英国SYNGENE 凝胶成像分析系统，对扩增产物的电泳条带进行灰度扫描，分析测定积分吸光度值(IA)。每例标本SOD2基因mRNA的相对表达量以SOD2片段的IA/ac

7、tin的IA比值来表示。13  统计学处理  采用SPSS100统计学软件。2  结果21  PCa及BPH组织中SOD2和actin基因RTPCR结果  引物SOD2基因扩增片段为252 bp,actin为393 bp，经琼脂糖凝胶电泳分析，扩增片段见图1。M:分子量Marker；1、2为PCa组织的SOD2及actin基因扩增条带;3、4为BPH组织的SOD2及actin基因扩增条带图1  SOD2基因的mRNA表达（略）22  PCa及BPH组织中SOD2基因的mRNA表达量分析  根据RTPCR半定量结果，

8、每份标本取其两次数据平均值，计算出其表达值。PCa 及 BPH中SOD2基因的mRNA表达水平分别为045±011和178±034，PCa组织中SOD2基因的mRNA表达水平较BPH组织显著低下(P005)。3  讨论    SOD为体内以O2·为唯一底物的天然酶类清除剂和自由基连锁反应的阻断剂，在保护细胞免受ROS的氧毒性损伤中发挥着重要作用。真核生物中主要含有CuZnSOD和MnSOD两种同工酶。SOD2基因编码MnSOD为存在于真核细胞线粒体基质中的一种抗氧化酶。线粒体氧化呼吸链电子传递过程是体内活性氧自由基产生的最主

9、要途径, MnSOD可首先清除这些自由基以防止自由基的累积和扩散, 因此MnSOD基因的表达和调控对机体内自由基清除的平衡体系至关重要。ROS还作为机体重要的信号分子，参与调控细胞的分化、增殖和凋亡等一系列生命活动, 与肿瘤的发生密切相关。研究认为MnSOD是一种新的肿瘤抑制因子，MnSOD的基因表达与肿瘤的分化程度和恶性表型相关。用基因转染的方法, 转染人MnSOD的正义cDNA, 使MnSOD过表达, 可抑制或逆转人恶性黑色素瘤细胞、神经胶质瘤和SV40转化肺成纤维母细胞系的恶性表型及生长58。本研究结果显示, PCa组织中SOD2基因的mRNA表达水平较BPH组织显著低下, 提示MnSO

10、D的下调表达导致的氧化应激加剧在PCa发生中亦起重要作用, 这为PCa的基因诊断和治疗提供了一个重要的靶向基因。但关于MnSOD参与肿瘤发生的机制, Huang等认为肿瘤细胞MnSOD表达下降, 导致细胞线粒体内ROS增加, 高浓度的ROS则可导致DNA损伤及基因不稳定性增加, 有助于肿瘤的发生和转化, 促进细胞增殖9。MnSOD基因序列启动子的突变及MnSDO的酪氨酸硝酸化也是导致癌组织MnSOD表达低下的重要因素10。此外, MnSOD表达异常可改变细胞内包括O2·在内的ROS的净水平, 后者作为细胞内重要的信号分子, 调节某些转录因子活性及基因表达,从而使调节细胞增殖的信号转导

11、通路发生改变, 可能是MnSOD关联肿瘤发生的另一分子机制11。    【参考文献】  1 孙颖浩我国前列腺癌的研究现状J中华泌尿外科杂志, 2004;25(2)：772 Sun YFree radicals, antioxidant enzymes and carcinogenesis JFree Radical Biol Med, 1990; 8:583993 Bravard A, Sabatier L, Hoffschir F, et alSOD2: a new type of tumorsuppressor geneJ Int Canc

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