分子生物学技术讲座(一)

1、分子生物学技术讲座(一)分子克隆的载体自本世纪50年代初沃森(JDWatson)和克里克(FCrick)提出关于DNA双螺旋模型学说以及70年代初期DNA限制性内切酶的发现和一整套DNA体外重组技术的建立，分子生物学技术以空前的速度蓬勃发展，建立了一套完整的技术体系，并在生命科学的各个研究领域得到广泛应用，成为不可取代的研究技术手段。同时，分子生物学技术已对农、林、牧、副、渔，食品，制药，化工，石油工业以及环境监测和保护等国民经济诸多领域产生深远的影响，为人类社会带来难以估量的社会效益和经济效益。本讲座将分子生物学技术分成几个专题进行介绍，首先介绍分子克隆载体。分子克隆载体在分子克隆技术中起着

2、重要作用。目前，在分子克隆中常用的载体是质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、单链丝状噬菌体载体和酵母人工染色载体。1 质粒载体质粒载体主要用于DNA分子的亚克隆，表达外源蛋白，DNA序列的测定和基因的体外重新构建等。由于质粒载体DNA与外源DNA重组操作简便，外源DNA在质粒载体中相对较稳定，质粒DNA的制备和纯化方便，快速简单，所以得到广泛应用。但它容纳外源DNA片段有限，通常最多为15kb左右，因为当质粒大于15kb时，转化效率明显下降。质粒载体与外源DNA重组原理见图1。11 质粒的基本特性 质粒通过细菌间的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子。1946年，莱德伯格(Led

3、erburg)和塔特姆(Tatum)发现的F因子是最早发现的质粒，1952年，由Lederburg正式命名为质粒。确切地讲，质粒是细菌内的共生遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型，例如对抗生素的抗性，产生抗生素，降解复杂有机化合物及限制酶与修饰酶等。质粒是一个双链、闭环的DNA分子，其大小为1200kb，它们都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位，但它们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录，它是比病毒更简单的原始生命。它有以下4个特性：(1)复制能力：质粒DNA的复制要由复制细菌染色体的多种酶系来完成，但不同质粒在宿主菌内复制起始阶段的机理以及所采用的酶

4、系迥然不同，并且在宿主菌内复制的程度也相差悬殊。(2)不相容性：利用同一复制系统的不同质粒，在细菌生长繁殖几代后，不能稳定地共存于细菌的一个单细胞中，称之为不相容性质粒。例如：带有ColEl和pMBl复制子的质粒彼此不相容；而带有pSC101和p15A复制子的质粒却彼此相容。(3)转移性：在自然条件下，许多质粒都能通过细菌结合作用转移到新宿主菌内，而质粒上的mob基因为转移所必需的基因；同时在质粒上还需要nicbom位点。(4)赋予宿主细胞一些遗传表型，如对抗生素的抗性。12 作为载体粒所具备的条件(1)分子相对较小，310kb；(2)具有松驰型的复制子，如ColEl，pMBl；(3)在复制子

5、外，存在一个或几个单一的内切酶位点；(4)具有筛选标记。2 噬菌体载体噬菌体载体作为克隆载体是在70年代初，此后它在分子克隆中始终起着重要作用。它主要用于cDNA文库和DNA文库的构建。不同的噬菌体载体能容纳外源DNA片段的长度约为025kb。21 噬菌体的基本特性和工作原理 噬菌体的基因组是一长度为50kb的双链DNA分子。在噬菌体颗粒内，该DNA分子为一线状分子，其末端为长12个核苷酸的互补单链(粘端)。当噬菌体进入宿主细胞后，其粘端被宿主细胞的DNA连接酶连接并形成闭环DNA分子，该DNA分子在感染早期充当转录模板。噬菌体有2种生长过程，即裂解性生长和溶源性生长。裂解性生长过程包括：吸附

6、，立即早期转录，延迟早期转录，DNA复制，晚期转录，噬菌体的组装和裂解。噬菌体载体与外源DNA重组原理见图2。22 噬菌体作为载体所要具备的条件 (1)具有自我复制能力；(2)含有多种限制内切酶的单一位点；(3)具有选择性标记以区别转化与非转化细胞；(4)分子量较小以便DNA体外操作。3 粘粒载体粘粒(Cosmid)载体最初是为克隆和增殖基因组DNA的大片断而设计的。因为用噬菌体载体构建真核细胞基因组文库，其容量仍受限制，最大插入片断不能超过25kb，而粘粒载体最大插入片断可达45kb。但由于技术方面问题，这种设想仅能部分地得到实现。粘粒载体的基本特性和工作原理 粘粒载体的基因组通常由以下几部

7、分组成：质粒复制的起始位点(ori)，多克隆位点，抗药性标记(例：氨苄青霉素抗性基因ampr)和噬菌体的粘性末端DNA片断(COS位点)。粘粒载体的大小为46kb，而插入片断可大至2945kb，粘粒载体与外源DNA重组原理见图3。应用粘粒载体在具体操作时仍比噬菌体载体克隆要困难的多，所以，如果不克隆大的片断，一般不用粘粒载体。4 单链丝状噬菌体载体大肠杆菌丝状噬菌体包括M13噬菌体、fl噬菌体和fd噬菌体。这些噬菌体均含有一个约6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。用此噬菌体作为克隆载体非常适用于：(1)DNA测序；(2)制备DNA探针；(3)定点诱变。通常用的单链丝状噬菌体载体是M13噬菌体

8、载体的mp系列，但是，用此类载体克隆过程中常常遇到两类问题，即外源DNA片断的部分缺失和外源DNA总是以单方向插入。如出现此类问题，可采用噬菌粒来克隆。噬菌粒(Phagemid)是带有丝状噬菌体复制起始点的质粒。它有以下优点：(1)双链DNA既稳定，又高产，并具有常规质粒的特征；(2)免除了将外源DNA片段从噬菌体载体亚克隆到质粒；(3)可克隆长达10kb的外源DNA片段。目前，最常用的噬菌粒是pBluescipt。5 酵母人工染色体载体酵母人工染色体(YAC)载体主要用于构建真核生物基因组DNA文库，因为真核生物许多基因过于庞大而不能作为单一片断克隆于以上提到的载体之中，例如，人凝血因子基因长180kb，肌营养不良基因至少长1800kb。酵母人工染色体(YAC)载体系统的基本原理与常规克隆载体类似。结构与噬菌体载体极为相似，YAC载体的二“臂”均带有选择标记和一些按适当方向排列的具有酵母端粒功能的DNA序列；另外，其中一臂上还带有两小