CD19CART细胞制备工艺

1、CD19-CAR-T细胞制备工艺规程1 目的：制备符合规定、合格的CD19-CAR-T细胞2 范围：3 职责：3.1 技术人：负责按本工艺规程进行细胞制备3.2 实验室主管：负责本工艺规程的执行。3.3 质量部：负责细胞制备全过程的监督和管理。4 内容：4.1 产品名称、剂型、规格：l 产品名称： CD19-CAR-Tl 产品剂型： l 规格：100mLl 性状： 液体l 存储条件及效期： l 内包装： 4.2 产品的质量标准：详见XXX细胞质量标准4.3 仪器、设备一览表：序号仪器设备性能要求序号仪器设备性能要求1洁净工作台/生物安全柜A级8条码打印机2二氧化碳培养箱9医用40C冰箱3普通离

2、心机10超低温冰箱4掌上离心机11热合机5倒置显微镜12水浴锅6可调式移液器（移液枪）13细胞计数仪7电动辅助移液器144.4 试剂一览表：序号试剂名称规格1细胞培养基1L/瓶2细胞因子A1ug/uL3细胞因子B106 IU/mL4淋巴细胞分离液500mL/瓶6转染增效剂8ug/mL7生理盐水500mL/瓶8CD19-CAR-T慢病毒上清10mL/支4.5 耗材一览表：序号耗材规格1细胞培养板24孔板6孔板2细胞培养瓶T25T75T1753培养袋2L/个4离心管15mL50mL250mL5移液管5mL10mL25mL6细胞滤网100目/个7输液袋100mL8巴氏吸管3mL/5mL9EP管1.5

3、mL4.6 试剂的配制：4.6.1 培养基：将1支106 IU的细胞因子B溶于1L培养基，配成完全培养基1。取40mL完全培养基1，加入2uL细胞因子A，配成完全培养基2。4.7 细胞制备工序要求：工序操作间洁净级别设备名称洁净级别细胞制备制备室C级洁净工作台/生物安全柜A级细胞培养培养室C级CO2培养箱C级细胞收集制备室C级洁净工作台/生物安全柜A级4.8 细胞制备流程图4.9 细胞制备：4.9.1 第0天：第0天外周血交接1、 技术员检查：Ø 存放血液的容器是否完好并密封；Ø 标识是否清晰完整并正确；Ø 血液是否结块，是否有溶血；Ø 血液量是否与标识

4、一致。2、 检查确认合格后，填写标本采集交接记录，双人签名确认。3、 接收外周血，并用75%酒精擦拭消毒2遍，移入制备区。制备前准备1、 淋巴细胞分离液和培养基恢复至室温。2、 准备好若干50mL离心管和24孔培养板。单个核细胞的分离提取1. 取出500uL全血置于一干净的1.5mL EP管中，用于血液三分类和流式检测。2. 将外周血用生理盐水按1:1体积比稀释。3. 加入15mL淋巴细胞分离液至50mL离心管管底，用25mL移液管将35mL血细胞小心缓慢铺在淋巴细胞分离液上（电动移液器吹液速度为零）。4. 1800rpm,20 min 常温离心，离心机升6降3。5. 小心移去生理盐水层，吸取

5、白膜层至50mL离心管，补加生理盐水至离心管满体积,500g，5min 常温离心。6. 倒去上清，加入生理盐水,重悬细胞，常温离心。洗2-3遍。7. 用完全培养基2重悬细胞，计数。T细胞重悬和诱导活化1、 按3×106个细胞/mL/well铺在24孔板上。2、 将24孔置于二氧化碳培养箱中（37，5%二氧化碳）培养。清场1、 将被血液污染的耗材弃置在生物安全垃圾袋中。2、 完全培养基1和2配制完后4度保存。注意事项1、4.9.2 第1天（细胞培养24小时）：第1天带CD19-CAR慢病毒上清转染T细胞1、将24孔板的细胞收集，用生理盐水洗涤两次，500g,5min常温离心。2、用带C

6、D19-CAR慢病毒上清重悬细胞，计数，并用病毒上清稀释至终浓度3×106个细胞/mL，加入总体积千分之一体积的转染增效剂。3、1000g，离心，2h。 4、在二氧化碳培养箱培养8小时后每个24孔板的孔补加500uL完全培养基1。注意事项1、4.9.3 第3天（转瓶、补液）第3天转瓶、补液1、将24孔板的细胞转入T75的细胞培养瓶，并补充等倍体积的完全培养基1进T75的细胞培养瓶。注意事项1、4.9.4 第5天（转袋、补液）：第5天CD19-CAR-T细胞转袋补液1、 补充完全培养基1至400mL后，转入2L的培养袋中继续培养。注意事项1、 转袋后间隔1天摊开手掌轻压一下培养袋，以推散细胞聚集。注意事项操作完，及时清场，并做好相关记录以及细胞制备档案填写。清场1、4.9.5 第10天（收获细胞）第10天收获细胞1、将2L培养袋的细胞培养液分装至225mL的离心管中，500g,5min。2、将细胞用生理盐水洗两次，并用100mL生理盐水重悬。3、将细胞悬液过细胞滤网后，进袋，密封。注意事项1、细胞进袋前注意收集上清液留作质检用。2、留取少