某公司泄密的crispr cas9操作流程

1、Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程Protocol No. PT140726-1Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程1，CRISPR-Cas9实验流程图如下：20bp15- CACCG3-3CAAA -5U62345Protocol No. PT140726-1CruiserTM 酶切细胞池，计算突变率；CruiserTM 酶切初筛阳性克隆； 将阳性克隆测序验证；做敲除序列比对分析。在细胞内 crRNA 识别靶位点，Cas9 对靶位点进行随机剪切。转化 G10

2、Competent Cell；筛选阳性克隆；测序验证序列； 质粒大提；电转染靶细胞。将双链 DNA 连接到载体中。pGK1.1设计 2 条单链 oligo 序列；退火形成双链 DNA。Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程2，操作步骤实验前，请您务必做好以下验证实验：A单细胞生长情况，确保单个细胞可以正常生长形成单克隆，即，低密度的细胞在培养皿中可以形成单克隆。B目的基因的表达情况分析，为防止因缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要 PCR 扩增靶基因，并对PCR 结果进析靶基因的活跃度。序，确保靶基因的完整；其次，您还可以用 RT-PCR 分1. 设计 Oligo

3、DNA 序列首先，您需要在靶标 DNA 区域中设计一对 20bp 左右的 oligo DNA，您可以通过以下在线工具设计： 麻省理工学院的CRISPR Design： 德国研究中心的E-Crisp：下面我们选择麻省理工学院的CRISPR Design 工具来做设计举例，以 Fut8 基因为例，一次只能输入大小为 23250bp 的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免 Guide 序列跨内含子的。点击“Download as genbank”按钮，出现以下界面：“Fut8”根据左边的 score 的高低选取合适的 Guide 序列，以 Guide#1 序列为例，2 条单链 oligo 的序列

4、如下（红色字体部分是要与 BbsI 酶切后的载体相互补的部分）：Fut8-F: caccGAATGAGCATAATCCAACGCC Fut8-R: aaacGGCGTTGGATTATGCTCATTC注意：oligo DNA 设计序列的第一个碱基必须是 G，如果你选取的 Guide 序列的第一个碱基不是 G，可自行加一个 G 上去。 另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续 PCR 或测序检测阳性克隆，引物能扩增约 300bp的 DN段，上游引物距突变位点约 100bp，下游引物距突变位点约 200bp。将设计后的序列送到值得信赖的公司，纯化级别为PAGE。2. T4 DNA Ligase

5、连接将后的 2 条单链 oligo DNA 退火形成双链DNA，再与载体连接，pGK1.1 linear vector 是线性化载体，无需酶切处理，可直接用于 T4 DNA Ligase 连接反应，pGK1.1 载体已经优化过，其转染和敲除的效率比CRISPR 载体更高。Protocol No. PT140726-1Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程退火反应体系如下：0.5l 0.5l 18l 1l正链 Oligo(100M) 负链 Oligo(100M) ddH2OAnnealing Buffer(20x)20l将以上体系瞬时离心后，置于 PCR 仪中 95

6、孵育 3min，孵育后自然冷却 20min。取 1.75l 的杂交后的双链 DNA 进行 T4 DNA Ligase 连接反应，反应体系如下：pGK1.1 linear vector双链DNAT4 DNA Ligase10xT4 DNA Ligase Buffer ddH2O2l 1.75l1l 1l 4.25l10l再进行 T4 DNA Ligase 连接反应。连接产物可以直接转化DH5a 高效感受态细胞，转化和筛选阳性克隆的实验步骤请您参考分子克隆实验指南，pGK1.1 的抗性为卡那霉素抗性，筛选后的阳性克隆，需测序验证序列的正确性。3. 电转染靶细胞(推荐)转染前进行质粒大提，确保质粒浓

7、度2g/l 浓度，再取 47g 进行电转染靶细胞，推荐使用 Celetrix细胞电转仪(型号：CTX-1500A)，贴壁细胞的数量需 1x1063x106，悬浮细胞的数量需 3x1065x106。另外，您也可以使用转染试剂转染靶细胞。4. 混合克隆 pool 检测48-72 小时后做有限稀释，5 块板足够，并取电转后细胞的 pool 1000 个细胞以上离心，去上清，PBS 洗一遍，细胞沉淀溶于适量的PBS 中，煮 5min 后模板就PCR 检测（以 Fut8 基因为例）：好了，剩余的 pool 细胞冻存。11 步骤所的模板5ul1ul 1ul 1ul 0.5ul 5ulFut8-seq-F(

8、10mM):Fut8-seq-R(10mM):dNTP Mixture(10mM each): Taq 酶：10XTaq 酶 buffer： Mgcl23ulH2O:33.5ulTotal程序：50ulcycles9595 X 72722m2020S301xcycles35x5mincycles1x95变性 5minPCR 产物使用 CruiserTM 酶切 15-20 分钟，酶切产物 1%-1.5%凝胶电泳。Protocol No. PT140726-1注意：请您根据步骤 1 自行设计正链 Oligo 序列和负链 Oligo 序列后的 2 条单链 oligo DNA 退火复性成双链 DNA，

9、Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程上图为混合克隆 pool 酶切检测，由此图可知此混合克隆 pool 中有敲除计算突变率。的细胞，则进行并5. CruiserTM 筛选阳性克隆将剩余的 pool 的靶细胞有限稀释后，分到 96 孔板中进行单克隆培养，如果靶细胞是悬浮细胞，推荐使用Cell Plaza(Cat.No.: GP08250)培养细胞，待细胞长好后，取 1000 个左右的细胞，提基因组，推荐使用 Genloci TNA 抽提试剂盒 (Cat.No.: GL10851S)。然后使用核酸内切酶初步筛选阳性克隆，推荐使用 Genloci CruiserTM

10、突变检测试剂盒(Cat.Nos.: GCMD025, GCMD100)，对 CruiserTM 筛选后的阳性克隆进 序分析，并对碱基缺失结果进行比对分析。Protocol No. PT140726-1Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程IV FAQQ-1：靶位点设计有哪些注意事项A-1：目前有几个在线设计，我们推荐使用 Zhang Feng lab：，该会对每一个潜在的靶位点打分，并告知是否脱靶现象。在设计 Guide 序列时，需要特别注意第一个碱基必须是G，如果您选取的 Guide 序列的第一个碱基不是 G，需要自行加上一个 G，因为这个 G 对于起始转录非常

11、重要。Q-2：转染效率低，怎么办？A-2：因为 Cas9 蛋白比较大，就导致整个敲除质粒较大（8kb 左右），如此大的质粒很容易导致转化效率低下，尤其是使用脂等化学试剂转染时，转染效率会比较低些。所以，我们推荐使用电转的进行转染。Bio-Rad 的电转仪器需要根据不同的细胞单独配制转染 buffer，所以不推荐使用；Life 的Neon 系统不错，但是因为耗材是镀金的，所以非常贵；而 Genloci 的 CTX-1500A 电转仪，转化效率高，不需要单独配制 buffer，只需使用无血清的培养基就行，而且该电转仪的耗材也是相对比较便宜的。Q-3：单个细胞不生长，怎么办？A-3：对于单细胞不长的

12、细胞进行敲除，首先建议采用共培养的看看能否促进单个细胞的生长。共培养可以采用培养过同种细胞的培养基培养单细胞；也可以使用 Cell PlazaTM（单细胞培养板），可以把细胞的存活率提高三倍以上。如果以上都不行，建议对细胞进行改造，加快其速度，让单细胞可以很容易生长后，再对目的基因进行敲除。具体可以Genloci 的做进一步的了解。Q-4：在做高通量样本时，如何才能快速筛选得到阳性克隆？A-4：建议使用错配酶进行筛选，可加快筛选的流程。目前市面上主要有三种错配酶：CruiserTM 酶、T7E I和 Surveyor 酶。其中，CruiserTM 酶和 Surveyor 酶属于 Cel I，这

13、两种酶的筛选特异性比 T7E I 高。在酶切筛选过程中，T7E1 的特异性较差，容易出现假阳性的结果，这在一定程度上阻碍了阳性克隆的筛选进度；Surveyor 酶较贵，并且货期较长，所以我们推荐 CruiserTM 酶，它特异性高且价格合理。Protocol No. PT140726-1Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程VI附录附录A pGK1.1 linear Vector以下为pGK1.1的位点示意图和质粒图谱，线性化pGK1.1所用的酶为BbsI。pGK1.1：Guide RNA：20bpFigure 3. pGK1.1位点图示Figure 4. pGK

14、1.1 质粒图谱Protocol No. PT140726-1Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程VII CruiserTM操作说明1，操作步骤1）基因组DNA 的准备提取细胞的基因组 DNA，推荐使用 Genloci 公司专为阳性克隆筛选设计的 TNA 抽提试剂盒（Cat. No.: GL10851S），只需500 个左右的细胞即可提取全基因组DNA，详细实验步骤请参看Genloci TNA 抽提试 剂盒（Cat. No.: GL10851S）说明书。2） 杂交DNA 的准备a) 第一轮和第二轮（）PCR 引物设计分别设计First Primers 和Nest

15、ed Primers。其中First Primers 要求具有较高的特异性，其扩增产物推 荐为5001000 bp，Nested Primers 推荐扩增产物长度为300600bp。First Primers 和Nested Primers引物对应目的序列的位置如下：2/31/3突变位点模板 DNA 第一轮 PCR 第二轮（产物First Primer）PCR产物Nested PrimerProtocol No. PT140726-1Genloci Biotechnologies Inc.Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程b)第一轮PCR：获得目的片段将已经提

16、取的基因组作为模板，使用First Primers，以DNA 聚合酶扩增获得目的片段，要求目 的片段明亮（少量杂条带，以及少量弥散）。同时获得野生型模板扩增产物和突变型模板扩增产物。 推荐扩增循环数3540 cycles，反应体系25 l，100 ng模板量300 ng。PCR 完成后，取78 l 进行电泳检测。c)第二轮（）PCR：获得杂交DNA根据第一轮PCR 电泳检测中目的条带的亮度，用无菌去离子水稀释扩增产物（可参照Marker 的亮度 估算产物中 DNA 的浓度，稀释至总核酸浓度为 1020 ng/l，需要稀释 1050 倍）。其中野生型模 板扩增产物标记为：WT DNA；待检测的突

17、变型模板扩增产物标记为：MT DNA；根据您的检测样本量的大 小取合适量的稀释产物作为第二轮PCR 的模板。小量样本的反应体系如下：MT DNA WT DNA5×Nested Buffer Mg2+ Buffer dNTP（10mM each） Nested Primer-F Nested Primer-RGNest DNA polymeraseddH2O2.5 l2.5 l5 l1.5 l0.5 l1.2 l1.2 l0.3 l10.3 lTotal Volume25 l大量样本的反应体系如下：MT DNA WT DNA5×Nested Buffer Mg2+ Buffe

18、r dNTP（10mM each） Nested Primer-F Nested Primer-RGNest DNA polymeraseddH2O1 l1 l2 l0.6 l0.2 l0.5 l0.5 l0.1 l4.1 lTotal Volume10 l注意：Ø若第一轮PCR 的扩增模板为混合模板，即同时含有野生型和突变型模板，则在第二轮PCR 无需混合WT DNA，取稀释后的扩增产物2 l 作为第二轮PCR 的模板。GNest DNA polymerase 置于-20保存，且避免操作污染。在60 s 内，GNest DNA polymerase 可扩Ø增1 kb 的D

19、N段。PCR 反应程序推荐如下：Protocol No. PT140726-1Genloci Biotechnologies Inc.Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程9494 Tm* 727295自然冷却40以下*Tm 值由Nested Primer 决定，为55左右。45 s10 s10 s#15-30 s45 s3 min10 min35 cycles#产物片段长度500 bp 时，建议为72，15 s；产物片段长度500 bp 时，建议为72，30 s。CruiserTM 酶切检测。扩增结束后，取2 l PCR 产物（实验组）用于3）CruiserTM

20、 酶筛选阳性克隆对照组和实验组杂交DNA 同时进行CruiserTM 酶切，步骤如下：1. 取一个新的0.20 ml 的PCR 反应管，加入2 l Positive control DNA，此为阳性对照组；2. 分别向实验组和对照组反应管中加入CruiserTM 核酸酶和5×CruiserTM 缓冲液，总体积为10 l，移液器吹打混匀，此步骤应置于冰浴上操作。酶切体系如下：3.将实验组和对照组置于PCR 仪中45孵育1520 min。PCR Products 5×CruiserTM Buffer CruiserTM EnzymeddH2O2 l2 l1 l5 lTotal

21、Volume Incubation TemperatureIncubation Time10 l 451520 min注意：CruiserTM 核酸酶、阳性对照置于-20保存，且避免操作污染。Protocol No. PT140726-1Genloci Biotechnologies Inc.Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程V结果分析酶切步骤结束后，应向上述10 l 反应体系内加入2l 6×Stop Buffer，随后进行琼脂糖电泳检测或置 于-20保存。当酶切后片段预计<500 bp 时，推荐使用 1.5%2%的琼脂糖凝胶电泳，若酶切片段的

22、大小 相近且需要将其显示，可提高琼脂糖凝胶浓度并延长电泳时间，凝胶最大浓度推荐2.5%。试剂盒中Positive Control DNA 为杂交后的DN段经，CruiserTM 核酸酶切割后形成三个明显片段，分别为393 bp、134 bp、259 bp，其中134 bp 和259 bp 片段是酶切后片段，而393 bp 片段为杂交形成的homo-duplex DN段，无酶切割位点，因此，片段大小不变。Figure 2 阳性对照的电泳结果M： 100 bp-DNA Marker CK+：Positive Control DNA注意：酶切验证阳性的克隆，若需要进序，需以第一轮 PCR 产物为模板

23、，使用相应的 DNA聚合酶、Nested Primer 引物进行扩增，回收片段送测序即可。Protocol No. PT140726-1Genloci Biotechnologies Inc.Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程VI FAQQ-1：电泳结果仅有原片段而无酶切条带？ A-1：造成该实验结果有以下几种可能：aDN bDN段中无突变位点，需要重新进行上游实验，可通过对该DN段进序验证；段中杂交DNA 含量过低，致使反应后条带不易观察到。该情况常见于cell pool 检测中，因 cellpool 中阳性克隆(靶基因突变细胞)比例过低，导致获得 DN段中

24、杂交 DNA 含量过少，此时 建议设立2-3 个重复分别进行PCR 检测，只要检测到CruiserTM 酶切条带，则可认为敲除克隆。cCruiserTM 核酸酶失活。使用试剂盒中的阳性对照同步进行实验以检测活性。，阳性Q-2：电泳结果中酶切条带大小不是预期大小？A-2：出现该情况表明的 DN段中含有其他杂交位点。首先，应确认的 DN段是否其他DNA 的污染；其次，根据酶切结果进行判定：若酶切后形成的各条带单一，可能在 DN段上含有其他 杂交位点，需通过DNA 测序检测；若形成的酶切条带数量远多于预期，且随机分布含一定弥散，则可能是 DNA片段扩增中，DNA 聚合酶错配扩增导致，使用DNA 聚合

25、酶重新进行扩增可消除影响。如果PCR 反应出现非特异性扩增的条带，也会导致同样情况，建议调整 PCR反应条件，以保证只有特异性扩增的 PCR 产物用于突变检测。Q-3：反应后，酶切的条带轻微弥散？A-3：该现象可能如下：当酶切后条带<200 bp，且经较长时间的核酸电泳，条带宽度变大，亮度不足时呈现类似弥散的带型； 当突变位点过长，尤其当突变长度达到 50 bp 以上时，酶切后条带易出现弥散现象，此时弥散程度会因酶 切后条带大小的不同而不同，片段越小弥散情况越明显。Q-4：CruiserTM Enzyme 检测结果是否会出现假阳性？A-4：CruiserTM Enzyme 是通过基因工程

26、生产的Cel I 同源核酸内切酶，具有更性、高度的特异性 和DNA 双链。目前为止，尚未有文献使用 CruiserTM高效性，它能够切割所有形式的碱基突变形成的Enzyme 或Cel I 会出现假阳性，或出现其他核酸酶活性。Q-5：电泳结果中酶切条带大小与预期一致，就一定是纯合子吗？A-5：因为杂交的DN带后，不能100% 隆和测序验证。段是通过PCR 得到的，所以特异性没有任何问题。在得到与预期一致的酶切 条该样本为纯合子，因为杂合子也能得出同样的结果。因此，需要进行PCR 片段的 TA 克Protocol No. PT140726-1Genloci Biotechnologies Inc.

27、Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程VII附录附录A 阳性对照说明等量野生型和突变型 DN段混合，经 98加热、自然冷却后形成的杂交DNA，该 DNA 链两 处突变，均为单碱基突变，突变点间距2 bp，如下图所示。经CruiserTM 核酸酶切割后形成三个明显片段， 分别为393 bp1、34 bp、259 bp其，中134 bp2、59 bp 为酶切形成的片段3，93 bp 为杂交形成的homo-duplex DN无酶切割位点， 因此，片段大小不变。阳性对照推荐用量：10 l 体系用量200 ng。段，附录B目的DNA说明提取基因组DNA 后，在设计First

28、 Primers 用于第一轮PCR 时，要求其具有较高的特异性，其扩增产 物推荐为5001000bp，Nested Primer 推荐扩增产物长度为300600 bp。在设计Nested Primer 时，应使突变位点位于片段的1/32/3 处，且反应后获得的片段大小不应小于100 bp，以尽可能增强酶切结果的 可观察性。例如：使用第二轮（）PCR 扩增获得全长为 400 bp 的 DN段，通过调整引物位置，使 得预计的突变位点位于距5-端140 bp 处，则CruiserTM 核酸酶酶切后获得片段应为140 bp、260 bp。若以1.5%2.0%琼脂糖进行凝胶电泳检测则可获得3 条清晰的片

29、段，大小分别为140 bp、260 bp、400 bp。 在进行CRISPR-Cas9T、ALEN 和ZFN 技术进行基因敲除的检测时，推荐检测的DN段大小为300600 bp；若用于长片段扩增突变检测，片段大小不受限制，但需适当延长反应时间，如调节反应时间为45 min；片段在凝胶电泳时应呈现清晰的单一条带。附录C酶切效果说明野生型和突变型模板DNA 混合后进行PCR 是为了获得特异性的序列和足够的量PCR 必须采用试剂盒中的5×Nested Buffer、Mg2+ Buffer 和GNest DNA polymerase 进行反应，以确保不影响后续CruiserTM 酶切反应。Protocol No. PT140726-1Genloci Biotechnologies Inc.Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程VIII.参考文献1.Yang B, W en X, Kodali N S, Oleykowski C A, Miller C G, Ku-linski J, Besac