荧光定量pcr半race电泳p c相关植物

1、实验 1植物总DNA 的提取生物总 DNA 的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总 DNA 的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取也不同，要根据具体的情况。本实验采用 CTAB 法提取植物总 DNA 的技术。来设计实验实验目的学习和掌握学习 CTAB 法提取植物总 DNA 的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定 DNA 的纯度和浓度。实验原理植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如 CTAB），可使白体，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA 进入，再用酚、氯仿抽提纯化。

2、本实验采用 CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在 CTAB 的处理下， 结合 65 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被出来。CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在（>0.7mM）浓度下可溶，并存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下 CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化 DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将 DNA 沉淀分离出来。由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其

3、衍生物的紫外吸收高峰在 260nm。纯的 DNA 样品 A260/2801.8，纯的 RNA 样品 A260/2802.0，并且 1g/ml DNA溶液 A260=0.020。实验器材1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料实验试剂1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mMTris25mM1.5M3%2%EDTANaCl CTAB-巯基乙醇12、TE 缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris

4、3;HCl 1mmol/L EDTA3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）4、95乙醇5、液氮实验步骤1、称取 2g 新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。2、将叶片剪成 1cm 长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。3、待液氮蒸发完后，加入 15mL 预热（60）的 CTAB 提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于 65水浴保温 0.5h，不时地轻轻摇动混匀。4、加等体积的氯仿/异戊醇，瓶塞，温和摇动，使成乳状液。5、将锥形瓶中的液体倒入 50ml 离心管中，在 4下 8000rpm 离心 10min。6、离心管中出现 3 层，用滴管地将上层清液吸入另一干净的离心管中，弃

5、去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。（根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。）7、收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入 2 倍体积预冷的 95乙醇。边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为 DNA）迅速缠绕在玻棒上。8、取下这些纤维状沉淀，加 12 mL 70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为 DNA 粗制品。9、将粗制品溶于 TE 缓冲液。10、在分光光度计上测定该溶液在 260nm/280nm 紫外光波长下的光密度值。注意事项1、液氮研磨时，操作，以免冻伤。2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。思考题1、 CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别

6、是什么？2、 液氮研磨的原理是什么？2实验 2质粒DNA 的提取和酶切质粒 DNA 是分子生物学实验中广泛应用的载体分子。质粒是细菌传物质，是环状的双链 DNA 分子。由于质粒比较小，并且能进行改造为克隆和表达的载体分子。于外的遗，常常被的自我限制性内切酶（Restriction enzyme，RE）是在细菌内发现的细菌降解外来 DNA 的保护机制。由于限制性内切酶通过识别特定的核酸双链序列并在特定的位点切断磷酸二酯键。不同的限制性内切酶识别的序列不同。实验目的通过本实验掌握碱裂解法提取质粒和限制性内切酶酶切的基本原理，掌握碱裂解小量提取质粒的实验技术。实验原理碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环

7、状质粒 DNA 与线性DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。在 pH 值介于 12.012.5 这个狭窄的范围内，线性的 DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒 DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入 pH4.8 的乙酸钾缓冲液恢复 pH 至中性时，共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体 DNA 的两条互补链彼此已完全，复性就那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，来而被除去。DNA 与不的大分子 RNA，蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下限制性内切酶通过识别特定的 D

8、NA 序列并在特定序列的特定位点打开磷酸酯键。实验器材1、恒温培养箱2、恒温摇床3、 台式离心机4、 高压灭菌锅5、 Tip 头、Eppendorg 管6、 含有目的质粒的 E.coli 菌株实验试剂1、 溶液 I50mmol/L 5 mmol/L 10mmol/L2、 溶液 II葡萄糖三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）0.4mol/LNaOH , 2% SDS ,用前等体积混合3、溶液 III5mol/L 乙酸钾冰乙酸水4、 TE 缓冲液10mmol/L Tris·HCl60mL11.5mL28.5mL1mmol/L ED

9、TA(pH8.0)5、 70%乙醇（放-20冰箱中，用后即放回）36、 EcoRI 及其缓冲液7、 HindIII 及其缓冲液实验步骤1、 将含有目的质粒的 E.coli 菌株接种于LB 液体培养基中，37振荡培养过夜。2、 取 1ml 培养物倒入 Eppendorf 管中，12000r/min 离心 30sec。3、 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。4、 将细菌沉淀悬浮于 100L 冰预冷的溶液 I 中，剧烈振荡。5、 加 200L 溶液 II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒 5 次，混匀内容物，将 Eppendorf在。6、 加入 150L 溶液 III（预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀

10、，放置 5min。7、 12000r/min，离心 5min，将上清液转至另一 Eppendorf 管中。8、 向上清液加入等体积的饱和酚，混匀。9、 12000r/min，离心 5min，将上清液转至另一 Eppendorf 管中。10、向上清液加入 2 倍体积乙醇，混匀后，室温放置 510min。12000r/min 离心 5min。倒去上清液，把 Eppendorf 管倒扣在吸水纸上，吸干液体。11、1ml 70%乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。12、20L TE 缓冲液，使 DNA 完全溶解，-20保存。13、取 4L 所提取的质粒 DNA，加

11、入 1L 酶切缓冲液，EcoRI 或 HindIII超纯水补至总体积 10L。37保温 2h 以上。14、酶切样品待琼脂糖电泳检测。注意事项操作时，避免剧烈震荡。思考题1、实验操作中，饱和酚的作用是什么？2、SDS 和 NaOH 的作用是什么？参考文献精编分子生物学实验指南（第四版）1L，用美 F M 奥斯伯，R E等主编 科学2005图 pBluescriptII SK 质粒载体4实验 3PCR 基因扩增PCR 技术是在 1985 年由酶链反应。这一技术具有划PE-Cetus 公司人类遗传研究室的 Mullis 等发明的聚合意义的。其原理类似于 DNA 的体内，只是在试管中给DNA 的体外提

12、供以致一种合适的条件-摸板 DNA ，寡核苷酸引物，DNA 聚合酶，合适的缓冲体系，DNA 变性、复性及延伸的温度与时间。实验原理多聚酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）的原理类似于 DNA 的天然过程。在待扩增的 DN段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA 扩增 2n 倍。1、 变性：加热使模板 DNA 在高温下（94）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链， 即变性阶段。2、 退火：使溶液温度降至 5060，模板 DNA 与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。3、 延伸：溶液反应温度升至 72，耐热 DNA

13、聚合酶以单链 DNA 为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按 53方向即引物的延伸阶段。出互补 DNA，上述 3一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸 3 个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的 DNA 量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过 2530 个循环后 DNA 可扩增 106109 倍。典型的 PCR 反应体系由如下组分组成：DNA 模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个的 DNA 引物、耐热 Taq 聚合酶。实验器材1、 PCR 热循环仪2、 tip 头、冰盒3、 PCR 管4、 超纯水5、 DNA 相对分子

14、质量标准物6、 移液枪实验试剂1、10×缓冲液500mmol/l KCl100mmol/l TrisHCl(pH8.3 ,室温) 15mmol/l MgCl20.1% 明胶2、4×dNTP1mmol/l dATP 1mmol/l dCTP 1mmol/l dGTP 1mmol/l dTTP3、Taq 酶4、DNA 模板5U/L1ng/L5、引物 1 、引物 2引物溶液浓度10pmol/l5实验步骤1、在 PCR 管内配制 20L 反应体系： 反应物10×buffer dNTP引物 1引物 2 Taq 酶Template ddH2O体积/L 2.01.01.01.0

15、0.5113.520总体积2、按下列程序进行扩增：、95预变性、95变性、55退火、72延伸、重复步骤30 次；、72延伸3、琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 结果5min 1min 1min1min10min配制 0.7%琼脂糖凝胶，取 10L 扩增产物电泳。保持电流 40mA。电泳结束后，紫外灯下观察结果。注意事项1、PCR 加样时，尽量保持低温操作，避免酶失活和模板、引物降解。3、 取样时注意不要污染药品。思考题1、什么是引物二聚体？出现引物二聚体的2、PCR 仪的热盖设置有什么优点？参考文献是什么？1、2、PCR 技术操作和应用指南 主编PCR 技术实验指南美C.W.人民军医G.S.德维克斯

16、勒1995 年科学2003 年6实验 4琼脂糖凝胶电泳检测 DNA琼脂糖是从琼脂中分离的链状多糖，其结构单元是 D-半乳糖-3,6-L 半乳糖。许多琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束， 该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。在 pH4.0-9.0由于其分子上无带电基团，在缓冲液离子强度大于 0.05 时，对蛋白质大网孔型凝胶。的缓冲液中。附作用，也无电渗现象，因而分辨率和重现性均较好，是一种优良的电泳材料。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，如 DNA 分子的电泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液对迁移率相关。实验目的学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测 DNA

17、的实验技术和原理，以及溴化乙锭染色检测核酸的实验技术。实验原理DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子的高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的 DN段泳动速度不一样，可进行分离。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的 DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的

18、DNA 分子，如 pUC19 质粒，有 3 种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒 DNA（covalentlyd circular DNA,cccDNA），开环质粒 OCDNA），线状质粒L DNA）。这 3 种构型DNA，即共价闭合环状质粒 DNA 1 条链断裂（open circular DNA ,DNA，即共价闭合环状质粒 DNA2 条链发生断裂（linear DNA,的质粒 DNA 分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈 3 条带，超螺旋质粒 DNA泳动最快，其次为线状 DNA，最慢的为开环质粒 DNA。溴化乙锭可以嵌入核酸分子，并且在紫外灯下产生荧光，可用于检测核酸物质。实验器材1

19、、琼脂糖凝胶电泳系统2、凝胶成像系统3、DNA marker4、 检测样品5、 琼脂糖实验试剂1、5×TBE（5 倍体积的 TBE 贮存液） 配 1000ml 5×TBE：Tris硼酸0.5mol/l EDTA2、凝胶加样缓冲液（6×） 溴酚蓝蔗糖3、溴化乙锭溶液（EB）54g 27.5g20ml（pH 8.0）0.25%40%0.5g/ml7实验步骤（一）琼脂糖凝胶1、按照被分离 DNA 的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖凝胶浓度/%0.30.60.70.91.21.52.0线性 DNA 的有效分离范围/kb 5601200.8100.570

20、.460.240.132、称取 0.3g 琼脂糖，放入锥形瓶中，加入 30ml 0.5×TBE 缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为 1%琼脂糖凝胶液。（二）胶板的1、 取有机内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。2、 有机内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。3、 将冷到 60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。内槽，直至有机板上形成4、 待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。5、 加入电泳缓冲液至电泳槽中，让缓冲液盖过凝胶。（三）加样用移液枪将将上样缓冲液与 DNA 样品按 1:5 比

21、例混合，加入加样及点样量）。（四）电泳（点样顺序1、接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DN段从负极向正极移动）。DNA 的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过 5V/cm。2、当溴酚蓝移动到距凝胶前沿 12cm 处，停止电泳。3、将凝胶放入溴化乙锭溶液中，染色 30min。4、将染色后的凝胶放入凝胶成像仪中拍照。注意事项因为 EB 是强参考文献物质，因此染色操作中应注意安全不要接触，并且保持环境的洁净。精编分子生物学实验指南（第四版）美 F M 奥斯伯，R E等主编 科学2005实验 5聚丙烯酰胺凝胶电泳实验目的1. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。2. 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术

22、，用于分离蛋白质。实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺作为支持物的一种电泳形式。单体-丙烯酰胺和交联剂-甲叉双丙烯酰胺相互作用可形成聚丙烯酰胺，该聚合反应以 TEMED 作为催化剂，以APS 作为剂。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的比例可决定凝胶网孔的大小，交联剂所占比重越大，凝胶的网孔就越小。CH2=CC=ONH CH2 NH C=OCH2=C甲叉双丙烯酰胺CH2=CC=ONH2丙烯酰胺APTEMED+CH2CH CH2CH CH2 CHC=ONH2C=ONH2C=O NH CH2 NHC=OCH2C CH2CH CH2CHC=ONH2C=ONH2聚丙烯酰胺利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离

23、主要依据以下两个因素：蛋白质所带静电荷：在不同的 pH 条件下蛋白质所带电荷不同。在一定的电场条件下蛋白质将向与其所带电荷相反的电极方向移动，移动速率取决于蛋白质表面电荷的数量，电压越强或电荷越多则蛋白质移动的越远。其次，蛋白质的形状和大小：蛋白质在电泳中所受的阻要取决于样品的大小与凝胶网孔大小之间的。蛋白质分子越小或凝胶网孔越大，所分离样品所受阻力就愈小，则在电场中的迁移率就越大。在非变性电泳中，天然蛋白质的分离就是蛋白质所带电荷、分子大小及分子形状等因素共同影响，作用的结果。9电压 x 样品静电荷迁移率摩擦力浓缩效应可显著提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率，该效应可通过引入浓缩胶和不连续缓冲溶

24、液系统而获得。浓缩胶处于分离胶的顶部，因此样品在进入分离胶之前首先要经过浓缩胶。它是由较低浓度的丙烯酰胺，当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔较分离胶网孔大，样品的移动速度较快，最终使样品“堆积”在浓缩胶和分离胶之间。另外，浓缩胶还具有比分离胶更低的pH。浓缩胶内的缓冲溶液是Tris-HCl（pH 6.7）, 该pH远低于Tris的pK值(8.1)。分离胶内的缓冲溶液是pH 8.9的Tris-HCl，而电泳正负两极的缓冲溶液均为pH 8.3的Tris-甘氨酸缓冲溶液。在浓缩胶中，小分子并带有大量负电荷的Cl-在凝胶中的移动速率较快，而电荷较少且分子量较大的甘氨酸的移动速率较慢。由于二者在同一电场中，

25、具有相同的电流，由此形成的电压梯度导致甘氨酸离子始终跟随在Cl-的后面，带有负电荷的蛋白质样品则浓缩在甘氨酸离子和Cl-之间向正极移动。当样品进入pH 8.9的分离胶时，甘氨酸的解离度增加，在电场中的迁移率高于样品，蛋白质不再夹离子之间向正极移动，这时的蛋白质依靠分子筛效应和电荷效应进行分离。-Tris/甘氨酸 pH 8.9样品缓冲溶液Tris/HCl pH 6.7浓缩胶Tris/HCl pH 6.7分离胶Tris/HCl pH 8.9+Tris/甘氨酸 pH 8.9实验材料1. 实验器材Bio-Rad 公司 Mini-Protean型电泳仪；电源（电压 200V，电流 500mA）；100沸

26、水浴；Eppendorf 管；微量注射器（50l 或 100l）；带盖的或小容器；摇床。102.实验试剂凝胶溶液的配方实验操作1.凝的取 l0cm×0.6cm 的底端管口用小块胶布管，选择较平整的一端为底端，量取 7.5cm、8cm 两处，画线；，橡皮垫中，垂直放置于试管架中。用滴管吸取分离胶，缓慢贴壁加胶到管内 7.5cm 处，立即加蒸馏水至 8cm 处。待分离胶凝固后，将胶面上的水分甩掉，残留的水分用滤纸条吸干，用滴管速加浓缩胶到分离胶面上至 8cm 处，再小心地加一层覆盖水。2.安装电泳槽11试剂分离胶（ml）浓缩胶(ml)125蒸馏水341.252.5- 6.1950.050

27、.005-1.01.257.640.100.005总体积（ml）1010Aa 浓度（g%）7.53.0试剂号配方pH1分离胶缓冲溶液1mol/L HCl48.0 ml三羟甲基氨基甲烷36.3 g加蒸馏水到 100ml8.92单体交联剂丙烯酰胺 （Acr）30g甲叉丙烯酰胺（Bis） 0.8g加蒸馏水到 100ml3过硫酸铵100mg/ml4四甲基乙二胺（TEMED）5浓缩胶缓冲溶液 1mol/L HCl48ml三羟甲基氨基甲烷 5.89 g加蒸馏水到 100ml6.76电极缓冲溶液甘氨酸28.8g三羟甲基氨基甲烷 6.0 g加蒸馏水到 1000ml, 用前稀释 10 倍8.37染色液CBB G

28、-250 0.1g 溶于 95%乙醇后，加蒸馏水到 100ml8示踪溴酚蓝 0.05g 溶于 100ml 蒸馏水9样品：蛇毒干粉 200mg 溶于 20ml, pH6.7 缓冲溶液（5） 中，再加入 25%蔗糖 20ml 和溴酚蓝（8）10ml选择无气泡、无裂缝、长度合适的小管，撕掉胶布，安装到电泳仪上，注意要紧密，以防止上槽缓冲溶液漏液；向下槽注入电极缓冲液，注意用弯头滴管除去管下端的气泡；再向上槽倒入电极缓冲液淹没小管，同样用滴管除去气泡。3.加样用微量注射器取样品液 30l，沿壁加在浓缩胶面上，注入时要慢，避免激起电极缓冲液。4.电泳连接电极，上槽与负极相连，下槽与正极相连；调节电流为

29、lmA管，待示踪进入分离胶时调节电流为 2mA管，待示踪时间为 2 小时3 小时。5.剥胶接近凝胶管底部约 0.5cm 处，切断电源，电泳取下凝胶管，用局麻针头注射器吸取一定量的蒸馏水，将针头-与管壁之间，边注水边旋转玻管，直至与管壁，然后用洗耳球轻轻在玻管的一端加压，使凝从玻管缓慢滑出，将凝置于编号的试管内，用蒸馏水冲洗几次。6.染色将考亮蓝染色剂倒入放有胶条的小试管中，没过胶条；60水浴保温 40 分钟50分钟后取出，用水冲洗 2 次3 次，观察结果。实验结果观察凝胶条中的蛋白质与考亮蓝染色剂结合后所形成的蓝色复合物，并通过画图记录结果。思考题 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离生物大分子的基本原理？

30、 样品液中加入蔗糖和溴酚蓝的目的是什么？12实验 6DNA 重组实验目的用T4DNA 连接酶将载体pBR322EcoR -CIP 处理的 DN段，与目的基因 5.4KbEcoR 片段连接起来，构建体外重组 DNA 分子，同时学习几种 DNA 连接的。实验原理2+重组的 DNA 分子是在 T4DNA 连接酶的作用下，有 Mg 、ATP的连接缓冲液系统中，将上述二种酶切后的 DNA 分子进行连接。（一）DNA 连接酶的作用步骤1T4DNA 连接酶与辅助因子 ATP 形成酶AMP 复合物（腺苷酰酶）2酶AMP 复合物再结合到具有 5´-磷酸基和 3´-羟基切口的 DNA 上，使

31、DNA 腺苷化。3产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。（二）DNA 的连接方式在 T4DNA 连接酶的作用下的 DNA 连接反应，是随机的，但也可以通过对载体、目的基因的处理以与调整 DNA 的有效连接。连接的方式有：1自连2两种片段相连3三个片段以上的自连与互连（三）连接反应的条件商品酶都带有 10 倍的缓冲液，有 Mg2、ATP 作为辅助因子，提供能量，1缓冲液：同时也有些保护与酶活性的物质，如 DTT（二硫苏糖醇）以防止酶的活性基因氧化失活。BSA（小牛血清蛋白）维持一定的蛋白量，以防止因蛋白浓度太低的酶变性失活。2温度：连接反应温度在 37时有利于连接酶的活性，但是在这个温度下，粘性

32、末端的氢键结合是不的，EcoR 酶所产生的末端，仅仅通过四个碱基对相结合，这不足以抵抗该温度下的分子热。因此在实际操作时，DNA 分子粘性末端的连接反应，其温度是折中采取催化反应与末端粘合的温度，为 1216。3时间：1216 1216 小时（过夜）；或 78 23 天。实验材料1pBR322 EcoR -CIP 处理 DN段。25.4Kb 含有 Str 的 EcoR 回收 DN段。3T4DNA 连接酶13实验仪器仪器、器皿（见附录）试剂：10×T4DNA 连接酶缓冲液660mmol/LTris-HCl(pH7.5)50mmol/LMgCl250mmol/LDDT50mmol/LAT

33、P实验步骤1取 3 只 Eppendorf 管，一管做重组连接，一管做 pBR322CIP 处理的自连，另一管做 pBR322 经 CIP 处理的自连。2用微量进样器按下表分别取样各溶液于 Eppendorf 管中。加样顺序为 ddH2O，10×T4 缓冲液，DN段，最后加 T4DNA 连接酶（放于冰浴中）连接酶取好后应立即放回20保存。3盖紧盖子用手指弹匀 Eppendorf 管，于台式离心机上转 2 秒钟，以集中样品。4将 3 管连接样品放入温度 12恒温水浴锅中，过夜。5第二天上午各25ng 的 DNA 连接液进行琼脂糖凝胶电泳，观察连接反应效果，电泳时要加入 pBR322 E

34、coR 酶切片段作电泳对照。思考题1连接反应为何选择在低温下长时间连接？14DNA 酶切反应物10×T4 连接缓冲液ddH2OT4DNA 连接酶总体积pBR322 EcoR-CIP5l（100ng） 5.4Kb EcoR 片段5l（约 400ng）2l7l1l20lpBR322 EcoR-CIP3l（60ng）2l14l1l20lpBR322 EcoR 3l（60ng）2l14l1l20l实验 7大肠杆菌感受态细胞的及转化在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合

35、转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA。转化过程所用的受体细胞内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它可以代。是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性外源 DNA 分子进入体内并地遗传给后实验目的学习和掌握 CaCl2实验原理备大肠杆菌感受态细胞的实验技术及热激转化的实验技术。细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态。转化是指质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于 0，CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42短时间热击处理，

36、促进细胞吸收 DNA 复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如 Ampr 等）得到表达，然后将此细菌培养物苄青霉素的选择性培养基上。含有氨实验器材1、超净工作台2、低温离心机3、恒温摇床4、恒温箱5、恒温水浴器6、 Eppendorf 管、Tip 头7、 转化的目的质粒8、 大肠杆菌菌株 DH59、 试管、培养皿、锥形瓶实验试剂1、1mol/l CaCl2 溶液（高压灭菌）2、LB 液体培养基配制每升培养基，应在 950ml 去离子水中加入： 胰蛋白胨（bacto-typtone）酵母提取液（bacto-yeast extract）10g5g15Na

37、Cl10g摇动容器直至溶质完全溶解，用 NaOH 调节 pH 至 7.0，加入去离子水至总体积为 1L， 121湿热灭菌 20 min。3、LB 固体培养基 1000ml 加 15g 琼脂。4、氨苄青霉素（Amp），用无菌水配制成 100mg/ml 溶液，置-20冰箱保存。实验步骤1、从大肠杆菌 DH5 平板上挑取一个单菌落接于 2mL LB 液体培养基的试管中，37 振荡培养过夜。2、取 0.5ml 菌液转接到一个含有 50ml LB 液体培养基锥形瓶中，37振荡培养 23 h。（此时，OD6000.40.5，细胞数务必<108/ml，此为实验的关键）。3、吸菌液 1ml 加入 Epp

38、endorf 管，10,000rpm 离心 15sec 回收细胞。4、用冰预冷的 0.1mol/l CaCl2 500L 悬浮沉淀。5、再离心 15 sec（10000rpm），回收细胞。6、 再用冰预冷的 0.1mol/l CaCl2 60L 重悬沉淀。7、 在-4下可保存 2 周（24 d 时，转化效率最高）。此细胞为感受态细胞。8、同时做两个对照管：受体菌对照：60L 感受态细胞 + 2L 无菌水质粒对照：60L 0.1mol/L CaCl2 溶液 + 2L 质粒 DNA 溶液9、将到 42循环水浴 12min。10、冰浴 2min。11、每800L LB 液体培养基，37培养 1 h（

39、慢摇）。12、将适当体积（200L）已转化的感受态细胞，13、.倒置平皿 37培养 1216 h，观察细菌生长情况。注意事项1、超净上无菌操作注意安全。2、实验过程中尽量避免杂菌污染。思考题含有氨苄青霉素的培养皿中。1、 CaCl2感受态的可能是什么？2、 如果平板培养后出现斑的可能3、 如何提高转化的效率？参考文献精编分子生物学实验指南（第四版）是什么？美 F M 奥斯伯，R E等主编 科学200516实验 8细菌总 RNA 提取实验目的了解 RNA 的特性，掌握 Trizol 法提取RNA 的原理及操作技术。实验原理RNA 分子是化学性质非常活跃的分子。在提取细胞内 RNA 在的过程中，R

40、NA易受细胞内核酸酶、化学试剂、机械震荡等多种因素影响而发生分子结构的破坏，导致提取失败。Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂，内含异硫酸胍等物质,能迅速破碎细胞，抑制细胞出核酸酶活性。Trizol 适用于从多种组织和细胞中快速分离总的 RNA。溶液与试剂 1、Trizol 试剂2、氯仿3、异戊醇4、无水乙醇，4保存5、70%乙醇，4保存6、超纯水7、2DEPC(二乙基焦碳酸酯)操作步骤材料准备E.coli 细胞过夜活化，第二天按 10%转接新培养基继续培养 4h。1、离心收集细胞样品经无菌水后，用液氮速冻，将组织磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时,将粉末转移到 Eppendorf 管中。每

41、 100mg 组织加入 1.0ml 的 Trizol.细胞样品:用常规收集细胞,按照 106-107 个细胞，加入 1mlTrizol.。注意：如果者细胞数很少(102-104)，在样品中加入 800ul 的 Trizol。剧烈振荡或用匀浆器匀浆。2、加入 200ul 氯仿/异戊醇(24:1)或氯仿，剧烈振荡混匀 30 秒。3、12000 转/分，4，离心 10 分钟。4、将上清液分钟。转移到 RNase-1.5ml 离心管中，加入与上清等体积的异丙醇,-20置 30注意：不要吸取任何中间层物质,否则会出现 Genomic DNA 污染。5、12000 转/分，4，离心 5 分钟。6、移去上清

42、液，防止沉淀丢失。7、用 70%洗涤两次，每次 700u，12000 转/分,4离心 5 分钟。8、尽可能彻底的吸走上清，防止丢失 RNA 沉淀。9、真空离心干燥 3-5 分钟或者放在室温下将空干。10、沉淀用 30-50ul 的 DEPC 水融解，检测，-70保存。结果采用电泳技术或光谱技术检测 RNA 的浓度、纯度情况。注意事项全程佩戴的来源。培养良手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染 RNA 的抽提并成为 RNA 酶微生物实验操作习惯预防微生物污染。17实验 9探针实验目的通过本实验掌握地高辛标记探针的实验原理。探针实际是已知的基因片段，应该该片段与待测样品杂交，如果靶基因和探针的核苷

43、酸序列互补，就可以根据碱基配对的原则进行核酸分子杂交，从而达到检测的目的。地高辛标记探针利用偶联抗体或抗生物素蛋白的磷酸酯酶检测经修饰的碱基，用氮蓝四唑（Nitro bluetetrazolium, NBT）显色，氮蓝四唑转变为不溶于水的有色物质，沉淀在杂交的原位。采用随机引物法筛标记反应液，以随机的六聚体核苷酸（ hexanucleotiide ）为引物， dATP 、dCTP 、 dGTP 、 dTTP 和 DIG­11­dUTP 为底物，单链 DNA 为模板，在 Klenow 酶的作用下，渗入 DIG 的 DNA 链。地高辛标记属高效标记反应，以 1 g DNA 探针

44、为例， 1 h 反应可产生 0.8 g 标记探针，20 h 可产生 2g 探针。同时，该标记片段大小 100 bp­10 kb，线性或高度卷曲 DNA 探针仪器、材料与试剂（四） 仪器1 、 水浴锅2 、 离心机（二）材料1 、 探针核酸片段2 、 PCR 小管（三）试剂操作简单，适用于含量 10 ng -3 g，。12、 10mM EDTA、 DIG random labeling Mix （高效）实验步骤12345用超纯水稀释 1g DNA 至总体积 16g 。DNA 热变性：将 DNA 置沸水中，水浴 10 min ，迅速加 4 l DIG random labeling Mi

45、x （高效），混匀后 2 000rpm置 37 反应至少 2 h ，反应时间越长,产量越高。、3min 以上。离心 5 min 。、加入 2 l 0.2M EDTA 或 65 度 10 分钟终止反应。反应液可在­20 保存至少 1、年以上，可反复使用 。实验安排PCR 实验完成后，将产物纯化即可开始探针。18实验 10Southern 杂交实验目的通过本实验了解 Southern 杂交的原理，学习 Southern 杂交的转膜和杂交技术操作的详细过程。实验原理Southern 杂交是一种在复杂背景基因中识别特异 DNA 序列的重要技术，是 Southern 在 1975 年首先发明的

46、。基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可以按碱基互补配对的原则退火形成双链。杂交的双方是待测核酸和标记探针。杂交过程是高度特异的。将电泳分离的 DN段在凝胶上经 N aOH 处理变性， 用硝酸纤维素膜（ nitrocellulose filter Membrane,NC 膜）放在凝胶上，使之按原有的顺序将条带转移到 NC膜并固定。这就是 Southern 转膜过程。Southern 杂交是将膜上的 DNA 与 DIG 标记的探针杂交，通过碱性磷酸酶显色检测结果。仪器、材料与试剂（一）仪器123、电泳槽、电泳仪、杂交炉或摇床（二）材料1 、 DIG 标记探针2 、 NC 膜（

47、5 cm X 5cm ）（三）试剂123、变性液：1.5M NaCl, 0.5M NaOH3 M NaCl, 0.5M Tris­HCl, pH 7 . 420 × SSC ）： 3M NaCl, 0.3M Na3Citrat, pH 7.0、中和液：、转移液（ 2× SSC ）： 0 .3M NaCl, 0.03M Na3Citrat, pH 7.0 Wash SolutionI ： 2 × SSC 、 0.1%SDSWash SolutionII ： 0 .5 × SSC 、 0.1%SDS456、（预）杂交液： 5 × SSC, N­laurolysarcosine,0.02%(w/v), SDS,1%(w/v), Blocking reagent,50% 甲 酰胺7 、­DIG­AP （碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体）8 、 BCIP/NBT 储备液199 、 冲洗液： 0.1MTris­HCl ， 0.15 MNaCl ， pH7.410 、封闭液： 0.1%Blocking reagent / 0.1MTris­HCl ， 0.15 MnaCl11 、显色液： 0.1MTris­HCl ， 0.1 MnaC