SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳

1、 实验目的实验目的 实验原理实验原理 实验材料和试剂实验材料和试剂 实验步骤实验步骤 结果处理结果处理 了解电泳实验原理了解电泳实验原理 掌握电泳实验操作规程掌握电泳实验操作规程 用电泳方法测定蛋白分子量用电泳方法测定蛋白分子量最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由OrnsteinOrnstein(1964) (1964) 和和Davis(1964) Davis(1964) 设计的设计的, , 样品和浓缩胶中含样品和浓缩胶中含 TrisTris- -HClHCl(pH (pH 6.8), 6.8), 上下槽缓冲液含上下槽缓冲液含TrisTris- -甘氨酸甘氨酸(

2、 (pH 8.3), pH 8.3), 分离胶中含分离胶中含TrisTris- -HClHCl(pH 8.8)(pH 8.8)。系统中所有组分都含有系统中所有组分都含有0.1% 0.1% 的的 SDS(SDS(LaemmliLaemmli, 1970), 1970)。样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, , 它推动样它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处品中的蛋白质前移

3、并在分离胶前沿积聚。此处pHpH值较高，值较高， 有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，后，SDS-SDS-蛋白质复合物成一电位和蛋白质复合物成一电位和pHpH值均匀的区带泳动穿过值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。 SDSSDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-SDS-蛋白蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它

4、们在水溶液质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的质的SDSSDS复合物的短轴长度都一样（约为复合物的短轴长度都一样（约为1818，即即1.81.8nmnm），），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的样的SDS-SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。长度也就是蛋白质分子量的函数。 SD

5、SSDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵笵围取决于用于灌胶的围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成形成SDSSDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随径随 “ “双丙烯酰胺丙烯酰胺双丙烯酰胺丙烯酰胺” ” 比率的增加而变小，比率的增加而变小，比率接近比率接近 1 1：20

6、20 时孔径达到最小值。时孔径达到最小值。SDSSDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶大多按凝胶大多按“双丙烯酰胺丙烯酰胺双丙烯酰胺丙烯酰胺”为为1 1：29 29 配制，配制，试验表明它能分离大小相差只有试验表明它能分离大小相差只有3% 3% 的蛋白质。的蛋白质。凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5 515%15%的丙烯酰胺所灌制凝的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：胶的线性分离范围如下表：丙烯酰胺浓度（丙烯酰胺浓度（% %）线性分离范围（线性分离范围（

7、kDkD） 1515121243431010161668687.57.5363694945.05.05757212212双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为 1 1：2929。试剂试剂丙烯酰胺和丙烯酰胺和N, N-N, N-亚甲双丙烯酰胺亚甲双丙烯酰胺十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）用于制备分离胶和积层胶的用于制备分离胶和积层胶的TrisTris缓冲液缓冲液TEMED(N,N,N,N-TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺) )过硫酸铵过硫酸铵TrisTris- -甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液样品处理液（样品处理液（5050mM TrismM T

8、ris- -HClHCl(pH 6.8)(pH 6.8)，100mM DTT(or 5% 100mM DTT(or 5% 巯巯基乙醇基乙醇) )，2% 2% SDSSDS，0.1% 0.1% 溴酚蓝，溴酚蓝，10%10%甘油）甘油）染色液（染色液（0.1% 0.1% 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 R250R250，40% 40% 甲醇甲醇10% 10% 冰醋酸）冰醋酸）脱色液（脱色液（10% 10% 甲醇，甲醇，10% 10% 冰醋酸）冰醋酸）1.1.配制配制SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试2.SDS2.SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制聚丙烯酰胺凝胶的灌制 迅速在两玻璃板的间

9、隙中灌注丙烯酰胺溶液迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液, ,留出灌注留出灌注浓缩胶所需空间浓缩胶所需空间( (梳子的齿长再加梳子的齿长再加0.50.5cm)cm)。再在胶液面再在胶液面上小心注入一层水（约上小心注入一层水（约2323mmmm高），以阻止氧气进入凝高），以阻止氧气进入凝胶溶液；胶溶液； 分离胶聚合完全后（约分离胶聚合完全后（约3030分钟），倾出覆盖水层，再分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水；用滤纸吸净残留水； 制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入备一定体积及一定浓度的丙

10、烯酰胺溶液，一旦加入TEMEDTEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。入下步操作。聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶, ,立即在浓缩胶溶液中插入干净的立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。空隙，将凝胶垂直放置于室温下。在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:11:1体积比体积比加入样品处理液，在加入样品处理液，在1001

11、00加热加热3 3分钟以使蛋白质变性。分钟以使蛋白质变性。浓缩胶聚合完全后（浓缩胶聚合完全后（3030分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入泳装置上，上下槽各加入TrisTris- -甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。凝胶底部两玻璃板之间的气泡。按予定顺序加样，加样量通常为按予定顺序加样，加样量通常为10102525ll（1.5mm1.5mm厚的胶）。厚的胶）。将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 8V/cmV/cm。当染料前沿进当染料前沿进入

12、分离胶后，把电压提高到入分离胶后，把电压提高到1515V/cmV/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约离胶底部上方约1 1cmcm，然后关闭电源。然后关闭电源。从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。3.3.用考马斯亮蓝对用考马斯亮蓝对SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色聚丙烯酰胺凝胶进行染色 经经SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝斯亮蓝R

13、250R250染色。染色染色。染色1 12 2小时或过夜。小时或过夜。4.4.换脱色液脱色，需换脱色液脱色，需3 31010小时，其间更换多次脱色液至小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。背景清楚。 此方法检测灵敏度为此方法检测灵敏度为0.20.21.0 1.0 mgmg。脱色后，可将凝胶脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。胶片。测量并计算分子量测量并计算分子量蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经3737种蛋白的测种蛋白的测定得到以下的关系式定得到以下的关系式 M