六味地黄丸微生物限度检查检验方法验证方案(2015年版)汇总

1、精品文档G M P文件湖北* * * *药业有限公司1. 概述1.1六味地黄丸（浓缩丸）是中国药典品种，批准文号：国药准字Z42020681,其处方由熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻组成，具有滋阴补肾之功效， 用于肾阴亏损，头晕耳鸣，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精，消渴。有效期：36个月。1.2根据剂型与产品处方判断，六味地黄丸（浓缩丸）的微生物限度检查内容应 包括需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，以及大肠埃希菌、沙门菌、耐胆盐革兰阴性菌 检查；根据六味地黄丸（浓缩丸）的成分和历史验证数据分析，该产品无明显的抑菌 活性，拟采用“平皿法”进行微生物限度检查，采用“常规法”进行控制菌检查。2.

2、目的确认所采用的方法适用于该产品的微生物计数， 以确保测定方法的可靠性，确保 检验结果的准确可靠。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应 重新进行适用性试验。3. 依据中国药典2015年版四部“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”、“非 无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”、“非无菌产品微生物限度标准”。4. 范围本验证方案适用于公司六味地黄丸微生物限度检查检验方法的适用性试验。5. 职责5.1验证领导小组5.1.1负责验证方案的审批。5.1.2负责验证的协调工作，以保证本验证方案规定项目的顺利实施。5.1.3负责验证数据及结果的审核。5.1.4负责验证报告的审批。5.1

3、.5负责发放验证证书。5.2质量部5.2.1负责验证所需的培养基、样品、菌液、缓冲液等的准备。5.2.2负责取样及对样品的检验。5.3项目验证小组5.3.1负责拟订验证方案。5.3.2负责验证方案的实施和收集各项验证试验记录，并对试验结果进行分析 后，起草验证报告，报验证领导小组。6. 验证实施条件6.1验证方案培训：在验证实施前，应对参与验证的人员进行验证方案以及与验证相关的文件进行培训，确保相关人员掌握了验证的相关要求与知识。6.2微生物限度检测室：检验所使用的检测室应经过HVAC系统确认，并符合要求。6.3 检验用水：验证过程使用的纯化水其制备系统应经过确认并符合要求，纯化 水质量应经过

4、检验并符合中国药典 2015 年版二部的要求。6.4 检验仪器设备：验证涉及的检验仪器(设备)与检验方法，应经过技术监督 局校验合格或者公司确认 / 验证合格。6.5 培养基：验证所使用的培养基应经过培养基的适用性检查，其结果符合中 国药典的相关要求。见附件 2: 培养基确认。6.6 验证菌种：验证所使用的菌种，其种类与传代次数应符合中国药典的相 关要求。菌种情况见附件 3: 菌种确认。7. 合格标准7.1 在需氧菌、霉菌及酵母菌计数的三次独立平行试验中，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.52范围内。7.2 在控制菌检查的试验中试验组应检出试验菌，阳性对照组

5、应检出试验菌，阴 性对照组不得检出试验菌。8. 验证方法8.1 菌液制备：8.1.1 取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念 珠菌的新鲜培养物各 1ml, 分别加 0.9%无菌氯化钠溶液 9ml， 10 倍递增稀释至 10-5-10-7。取黑曲霉的新鲜培养物加入 3-5ml含0.05% (ml/ml )聚山梨脂80的0.9% 无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05% (ml/ml )聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉抱子 悬液。8.1.2取1ml上述制备的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯

6、草芽 抱杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液分别注入平皿中， 立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养 基，每株试验菌平行制备 2个平皿，按平皿法测定其菌数。8.1.3、取1ml上述制备白色念珠菌、黑曲霉菌液注入平皿中，立即倾注沙氏葡 萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，按平皿法测定其菌数。8.1.4 结果：见附件 4:菌液浓度确定。8.2 需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验8.2.1供试液制备：称取供试品10g,用胰酪大豆胨液体培养基稀释至100ml，用 匀浆仪等适宜的方法混匀，制成 1:10 供试液。8.2.2试验组：吸取1:10的供试液9.9ml ,共5份，每份中加入0.1ml的试验菌 悬液

7、后摇匀。2欢迎。2下载精品文档试验组:保证呼皿中的试验菌数不大于10Ocfu-稀释度依据样品特 厶二:-性，质童标准制宦二根据供试41的理化 特性与生物学特性 ,采取适宜的方法 制备合适的供试液.9.9ml供试揪k一+0.1 E金黄色葡荀球W-* 牛+ 0.1 ml铜绿假单胞菌液 + 0.1 ml枯草芽抱杆菌液-* V卜一 +0Jmia色念珠液 - * + O.lmlflft曲莓菌液L.菌液对照品：吸取稀释液胰酪大豆胨液体培养基9.9ml，共5份，每份中加入与试验组相同的菌悬液后摇匀+0.1 ml金黄色葡需球菌液+ 0.讪1铜绿假单砲歯液不含中和剂及灭活剂 的相应稀释液分装5份9.9ml稀释浊

8、草芽疱杆蘭液+ 0.1ml白色念珠菌液+ 0.1ml黑曲15菌液8.2.4试验组和菌液对照组摇匀后，分别从所有试验菌试管中吸取1ml注入直径 90mm的平皿中，倾注胰酪大豆胨固体培养基；另分别吸取白色念珠菌 1ml注入直径 90mm的平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；平行 2份。8.2.5供试品对照组：吸取1:10的供试液1ml注入直径90mm勺平皿中，平行四 份，其中两个平皿中注入胰酪大豆胨琼脂培养基，另两个注入沙氏葡萄糖琼脂培养基， 摇匀。8.2.6将以上平皿分别置3035C或2025C培养，需氧菌培养不超过 3天， 真菌培养不超过5天，在3天和5天分别进行计数。8.2.7计算公式：试验组

9、菌落数供试品对照组菌落数菌液对照组菌落数0.5 24欢迎下载精品文档828试验结果：828.1见附件5:需氧菌总数计数方法适用性检查结果828.2附件6:霉菌和酵母菌总数计数方法适用性检查结果8.3控制菌检查8.3.1大肠埃希菌方法适性和供试品检查-九&埃希曹检査方袪方注适用性相当于伽fmk 10cm：样品相当手1, 1mL 10cm-样品1 11脛酪大豆陈液体培养墓胰酹大豆牒液体培养基（大肠）I 3035匸站养怕24小日寸30-35V培养怕小时1丨 1ml|lml麦康凯液体焰养基麦康凯肉汤142-41018 养 24*48 小时|42-44V8 养 24 小时麦康凯琼脂培养基麦康凯瞌脂诸养基

10、130-35ti 养 1872 小时养 18 小时若平板上有園落生长.应进荷纯化及与阳性对熊相比，園落形态一适宜的鉴定试验.狡，阳性对照计数不大于lOOcfgr阳性对黑L阴性对服831.1供试液制备：同“需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验”供试液 制备。8.3.1.2 试验组：取1: 10供试液10ml和w 100cfu大肠埃希菌菌液加入100ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，3035C培养1824h;取上述培养物1ml接种至 100ml麦康凯液体培养基中，4244C培养2448h;取麦康凯液体培养物划线接种 于麦康凯琼脂培养基平板上，3035 T培养1872h。8.3.1.3阳性对照：

11、取w 100cfu大肠埃希菌菌液加入100ml胰酪大豆胨液体培养 基中，其他同试验组。8.3.1.4 阴性对照：取100ml胰酪大豆胨液体培养基，3035C培养1824h; 其他同试验组。8.3.1.5结果：见附件6:大肠埃希菌方法适用性检查结果8.3.2沙门菌5欢迎下载精品文档方法适用性和供试品检査-沙门菌6欢迎下载精品文档#欢迎下载精品文档取供试液10ml和w 100cfu乙型副伤寒沙门菌菌液，加入 200ml胰酪 混匀， 3035 T培养1824h。取上述培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，3035C取少量RV沙门增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼3035

12、 E培养1848h。阳性对照：取w 100cfu乙型副伤寒沙门菌试验菌液，加入 200ml胰酪 其他同试验组。阴性对照：取200ml胰酪大豆胨液体培养基，30-35 C培养18-24h。其结果：见附件7:沙门菌方法适用性检查结果氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验：供试液检查方注10gi tonll, tOcrn2样品I胰酪大豆眛液体培养基1305匸培养1424小时 OJmlRV沙门菌增画浹体培养 |30-35t：培养13弋4小日寸木糖赖氛酸脱氣艇酸站 脂培养篡平板 30-35XJ培养1878小时18落为淡红鱼戒无色、透明或半遴明、中心有或 无躍电o用三糟牲讲一步鉴别，is18-24小 时f戒

13、采用其它适宜方法进一芳症定*r阳性对照 L阴性对照8.321供试液制备：同“需制备。8.322试验组：8.3.2.2.1大豆胨液体培养基中8.3.2.2.2培养1824h。8.3.2.2.3脂培养基平板上，8.3.2.3大豆胨液体培养基。8.3.2.4他同试验组8.3.2.5方达适用性10qt 10mL 10cm?样品I胰酪大豆籐液体培养基（沙门） 3D-35fiS养個小时 0 1mlRW少门菌增屋液体培养基木糖藏氨酸脱彌酸盐琼脂埴养基孚梔30-35X：培养1SP卜时I与阳性对照相比，菌蓿形态一致阳性对黑计数不大于10Ccfu，#欢迎下载精品文档8.3.3.耐胆盐革兰阴性菌#欢迎下载精品文档方

14、法适用性和供试品检查.耐胆盐革兰阴性菌定性检査方徒方进诸用性预t畜养：將轴备好前卄10的供试河在和条好的供试範中加入目标酋，在培养.增养时间使供试品20-25 V培薜2小时.中的细葡恢童但不増砸（葩I2小时）月当于W* ImkI相当于1rrt lOcrrSI11腸盘園増園港悽培界基（大廉）刃35匸垢？P44S小rt! 30*35匚蜡界24小时需红徂盐筈爺盘琼航（VR0A| 303St!培养斗小时|30-35tslFl& 小时VREA：无3!莖生刘未捡土耐胆VRBA：芍阳性歸略佛比，莒忑卅愍一致盐耳兰氏阴性杆苗.阴畔对冏计数不大于f阳性对聘9833.1供试液制备：称取供试品10g,用胰酪大豆胨液

15、体培养基稀释至100ml, 用匀浆仪等适宜的方法混匀，制成 1:10、1:100、1:1000的供试液，2025C培养 2h。8.3.3.2试验组：取10ml/支肠道菌增菌液体培养基3支，分别加入上述预培养 的1:10、1:100、1:1000的供试液各1ml,和w 100cfu大肠埃希菌菌液，混匀，30 35C培养2448h;取上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上， 3035 T培养1824h。8.3.3.3阳性对照：取w 100cfu大肠埃希菌菌液加入10ml/支的肠道增菌液体培 养基中，混匀，3035E培养2448h;其他同试验组。8.3.3.4阴性对照：取1支肠道增菌液

16、体培养基10ml管，加入胰酪大豆胨液体 培养基 1ml，混匀，3035E培养2448h;其他同试验组。8.3.3.5结果：见表9:耐胆盐革兰阴性菌方法适用性检查结果。8.3.3.6结论：三个批次样品，试验组均：检出，未检出试验菌；阳性对照 组均：检出，未检出试验菌；阴性对照组均：检出，未检出试验菌，拟定该 产品耐胆盐革兰阴性菌检查采用法进行检查。8.3.3.7结果：见附件9:耐胆盐革兰阴性菌方法适用性检查结果9. 异常情况与偏差处理：当出现偏差时，应按偏差处理管理规程进行处理。10. 验证结果评定、结论与建议验证小组组长负责收集各项验证、试验记录，根据验证、试验结果对验证效果进 行综合评审，起

17、草验证报告、做出验证结论。对验证结果的评审应包括一下内容：10.1验证试验是否有遗漏？10.2验证实施过程中对验证方案有无修改？修改原因、依据以及是否经过批准？10.3验证记录是否完整？10.4验证试验结果是否符合标准要求？偏差及对偏差的说明是否合理？是否需 要进一步补充试验？11. 附件11.1 附件1:验证实施条件确认11.2 附件2:培养基确认11.3 附件3:菌种确认11.4 附件4:菌液浓度确定11.5 附件5:需氧菌总数计数方法适用性检查结果11.6 附件6:霉菌和酵母菌总数计数方法适用性检查结果11.7 附件7:大肠埃希菌菌方法适用性检查结果11.8 附件8:沙门菌方法适用性检查

18、结果11.9 附件9:耐胆盐革兰阴性菌方法适用性检查结果11.10附件10:验证结果审批表附件1：设施设备验证确认设施设备名称验证报告编号验证结果实验室HVAC系统纯化水系统LDZX-40A型立式自控电热压力蒸汽灭菌器PSH-500A型牛化培养箱303AS-2型电热恒温隔水式培养箱SW-CJ-1C型双人净化工作台确认结论:确认人：确认日期:附件2：培养基确认培养基名称来源批号适用性检查结果胰酪大豆胨琼脂培养基胰酪大豆胨液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基胰酪大豆胨琼脂对照培养基/胰酪大豆胨液体对照培养基/沙氏葡萄糖琼脂对照培养基/麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基麦康凯液体对照培养基/麦康凯琼脂对照培

19、养基/RV沙门菌增菌液体培养基木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基三糖铁琼脂培养基RV沙门菌增菌液体培养基/木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂对照培养基/三糖铁琼脂对照培养基/肠道菌增菌液体培养基紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基肠道菌增菌液体对照培养基/紫红胆盐葡萄糖琼脂对照培养基/确认结论:确认人：确认日期:附件3:菌种确认培养基名称来源批号金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26 003铜绿假单胞菌CMCC(B ) 10 104枯草芽抱杆菌CMCC(B) 63 501白色念珠菌CMCC(F ) 98 001大肠埃希菌CMCC(B) 44 102黑曲霉CMCC(B) 98 003确认结论:确认人:确认日期:附件4:菌液浓

20、度确定10-310-410-510-610-7InmInmInmInmInm铜绿 假单 胞菌皿1皿2金黄 色葡 萄球 菌皿1皿2大肠 埃希 菌皿1皿2枯草芽抱杆菌皿1皿2白色 念珠 菌皿1皿2白色 念珠 菌（沙氏）皿1皿2黑曲 霉皿1皿2黑曲 霉（沙 氏）皿1皿2结论:根据要求，菌数要控制在每1ml中含菌数在w 100cfu，因此，我们确定菌液制备：铜绿假单胞菌：稀释金黄色葡萄球菌：稀释大肠埃希菌：稀释枯草芽抱杆菌：稀释白色念珠菌（胰酪）：稀释白色念珠菌（沙氏）：稀释黑曲霉（胰酪）:稀释黑曲霉（沙氏）：稀释检验人检验时间年 月曰-年 月曰复核人复核时间年 月日附件5:需氧菌总数计数方法适用性检查结果样品批号:菌种菌液对照组试验组比值(0.5-2 )稀释度:1:103天5天3天5天3天5天金黄色葡萄球菌/铜绿假单胞菌/枯草芽抱杆菌/12欢迎下载精品文档白色念珠菌黑曲霉供试品对照组：胰酪大豆胨琼脂培养基：（）CFU/平皿1,（） CFU/平皿2阴性对照组：胰酪大豆胨琼脂培养基：（）CFU/平皿1，（）CFU/平皿2检验人检验时间年 月曰-年 月曰复核人复核时间年 月日附件6:霉菌和酵母菌总数计数方法适用性检查结果样品批号：菌种菌液对照组试验组比值（0.5-2）3天5天3天5天3天5天白色念珠菌黑曲霉供试