时间尺度细菌组成

1、对虾养殖过程中浮游细菌群落在时间尺度上可预测的演替规律裘钱玲琳a，熊金波a，朱建林b，赵群芬a， 陈和平a,b，张德民a*a海洋学院，宁波大学，宁波，315211，中国b建筑工程与环境学院，宁波大学，宁波，315211，中国摘要：微生物群落的空间分布，即群落相似性随空间距离衰减已被广泛接受，但鲜有微生物群落在时间尺度上演替规律的报道。因此，微生物群落在空间和时间尺度上是否具有相似的变化规律仍不明确。本实验利用高通量测序，研究对虾养殖过程中细菌在时间尺度上的变化规律。研究发现：细菌群落的相似性随时间显著（p=0.002）降低，周转率w=0.004，而多样性并没有显著变化。群落结构随时间不断变化，

2、但连续采样点样品间相似性却较高。不同池塘细菌群落的时间演替有着相似的规律，说明细菌群落的时间尺度上动态演替一定程度上是可以预测的。细菌群落结构的变化与叶绿素a、总氮、磷酸盐、碳氮比紧密相关。本研究建立了细菌群落相似性在时间尺度上变化的模型，表明细菌群落在时间和空间尺度上具有相似的演替规律。关键词：浮游细菌； 时间动态演替； 周转率； 相似性时间关系1 引言“养殖病害是养殖主体、养殖环境以及周围菌群相互作用的结果”1，三者密切相关。对虾养殖过程中微生物群落的动态演替（尤其在健康塘以及病害塘特定微生物群落）已被证实2-5。这表明浮游细菌在维持虾体健康方面起着重要作用6, 7，特定的细菌可以区分对虾

3、的健康状态。因此细菌群落时间演替的研究能有力地预测对虾疾病的出现。为了维持高产量，饲料的供应量远远超过对虾的需求量，这使得受纳水体逐渐富营养化 8, 9。然而，资源的分区是微生物的组成、功能结构的关键因素10, 11，可能会导致微生物群落在对虾养殖过程中的演替。近来研究表明，对虾养殖中微生物群落体现出在时间尺度上的演替6, 7, 12。这些研究只停留在利用特定的技术研究13特定类群（如弧菌）7, 14，并不能全面理解群落在时间尺度上如何加剧富营养化。尽管已经研究出天然水生生态系统中群落在时间尺度上的动态演替模式2, 5，目前不清楚动态演替在人为操纵的池塘中（一个不断变化的环境）是否具有可预见性

4、。在空间尺度上微生物群落相似性随距离衰减15, 16（即群落差异性随地理位置增强），然而相似性与时间的关系（STRs）模式鲜有深入的研究4。Jones以及他的团队17假设水体细菌群落组成在时间尺度以及空间尺度上的变化是同等重要的。然而目前对于时间尺度上的研究一般针对于系统发育与时间的关系，即在时间尺度上的不同生态系统物种累积丰度19-22。因此，微生物群落在时间尺度上是否存在类似于空间尺度的时间与相似性之间的关系并不确定。由此，我们用类似空间尺度的数学公式：S = cTw 18，其中标度指数w反映了微生物群落的周转率。 虾塘在放养虾苗之前经过消毒，是一个相对比较清洁的环境，且各虾塘在养殖全程采

5、用相同的管理，实验在此基础上对微生物群落在时间尺度上的动态演替进行了详细的研究23。不同的细菌类群在代谢作用上存在本质的不同，由此推断由于对虾养殖过程中存在资源的分区17, 18，则间接表明细菌群落动态演替较活跃（存在高周转率）。实验从时间尺度上采集对虾养殖池塘水样，并且应用高通量测序技术探究浮游细菌群落在时间尺度上的动态演替规律以及找出主要环境因子，并进一步探究在空间尺度的影响下相似性与时间之间是否存在一定关系。2 材料与方法2.1 实验设计和水样采集对虾养殖池塘位于宁波瞻岐（北纬29°32，东经121°31）。30个养殖塘大小一致（约2000 m2），放养密度、饲料类型

6、以及养殖进程等都采用相同的管理。2012年3月25日，统一放虾苗。从6个不同的养殖塘采集水样，采样距水表面50cm。水样取自不同时间点（周期42d，从4月29日至6月10日，每次采样时间点间隔610d），对应于放虾苗后的第35d、45d、55d、63d、69d、77d，共收集36个水样（6个养殖塘×6个时间点）。样品利用冰袋降温保存，并在4h内送往实验室。水温和pH利用仪器在距水面50cm处现场测量。总有机碳含量（TOC）、总氮（TN）、总磷（TP）、化学需氧量（COD）、NO3- 和PO43-浓度的监测分析按照标准方法（APHA，1989）24。叶绿素a的测定时，水样经25mm的

7、GF/F的过滤器过滤，用90%的二甲基甲酰胺在48恒温下萃取24h，最后使用分光光度计（UV-1601, Shimadzu）测定水体中的叶绿素a浓度。2.2 DNA提取采集大约3L水样提取DNA，水样应预先经尼龙筛（滤径100m）过滤，随后经0.2m的滤膜（Millipore, Boston, MA, USA）过滤。使用Power Soil® DNA Isolation Kit试剂盒（MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA），按照试剂盒说明书提取总DNA。DNA浓度通过NanoDrop ND-1000分光光度计（NanoDrop Technolo

8、gies, Wilmington, USA）测定，并贮存在-80冰箱。2.3 细菌16S rRNA基因扩增和454测序每个DNA样品各取50ng作为PCR扩增的模板，使用引物对细菌的16SrRNA基因19V1V3高变区进行扩增，27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，通过罗氏454高磷酸测序适配器A找出11bp大小的barcode标识序列。519R： GWATTACCGCGGCKGCTG，每个样品扩增有特定的barcode。在50l体系中扩增： 94变性30s，55退火30s，72延伸30s，进行30个循环，最后一次72延伸10min。 将每个样品PCR产物合并，采用纯化试剂盒（Ta

9、KaRa）纯化，PCR产物采用Quant-ItTM PicoGreen kit（Invitrogen, Carlsbad, CA）定量分析。等摩尔量PCR产物单独放置，用罗氏FLX454焦磷酸测序机（Roche Diagnostics Corporation, Branford, CT, USA），从有barcode的27F方向开始读数。2.4 测序数据处理测序结果利用QIIME的程序25进行处理，嵌合体检查和降噪处理。用PyroNoise筛选出长度为200 450 bp以及小于6的最大均聚物的序列26，并将带有相同barcode标识序列的序列归为同一样品25。利用uclust27确定细菌的种

10、系型，并将比对大于97%的序列归为同一OTU（Operational Taxonomic Unit）。通过Greengenes数据库28分类各种系型。为避免误差，随机选取4500条序列的子序列进行进一步分析。2.5 统计分析利用单因素方差（SPSS 13.0）分析不同采样点位的多样性指数。采用非度量多维尺度（NMDS）的方法评估整体细菌群落结构的差异而产生的多样性29。非参数多元方差分析（perMANOVA）分析不同采样时间对于微生物群落变化的影响。利用PAST计算相似比例，并分析不同采样点主要类群3, 31。为了减少多重共线性，利用R v.2.11.0中vegan软件包32，基于方差膨胀因子

11、（VIF）对采用CCA分析主要环境因子与细菌群落之间的关系。2.6 时间周转率评估和相似性时间关系相似性时间关系模式（STRs）采用幂函数估算，S = cTw，其中w：尺度指数，表示细菌群落周转率，这从空间尺度指数借鉴而来18。Sørensen指数更着重于类群分析33，因此利用STRs来评估微生物群落可以发现相似性随着时间推移累积降低。由于采样时间的设计，每个池塘的分析数据点不是独立，我们分别将采样点D35（第一个采样点）与其他采样点（D45，D55，D63，D69，D77）进行计算细菌群落相似性，再根据采样时间取各自相似性平均值。幂指数w的计算式直接利用线性回归的方法，绘制log

12、log函数: logS = logc + wlogT，用来评估相似性与时间的关系18, 21。3 结果3.1 水质化学指标由于是大棚养殖，水体温度以及pH变化相对比较稳定，温度变化范围：27.330.9，pH变化范围：6.187.05。NO3- 和 PO43-这两个环境因子在养殖塘变化相对比较明显，TOC在整个对虾养殖周期持续增加（r = 0.730, P < 0.001, Pearson相关）。另外，随着叶绿素a增加，TP、NO3-浓度也逐渐增加。以上结果与以往关于对虾养殖过程的研究一致7, 12。3.2 类群分布与系统发育测序结果中有8个样品测序质量低，其中有4个来源于D35另外4个

13、来源于D45。实验没有足够DNA对这8个样品进行焦磷酸测序，在进一步分析中将这8个样品移除。经过这个步骤后，我们总共获得195640序列，每个样品有45028285条序列（平均有6987条），其中能够分类95.3%。这些样品按门或纲分类有Actinobacteria（平均相对丰度为11.9%），Alphaproteobacteria（20.5%），Gammaproteobacteria (6.7%)，Flavobacteria (23.5%) 以及Sphingobacteria (6.0%)，以上占细菌总数的68%。虽然对于门或纲研究没有完全统一的模式（如线性增加或减少），运用通常一些方法，可

14、以得出随着时间推移Alphaproteobacteria和Sphingobacteria相对丰度下降，而Gammaproteobacteria 和Betaproteobacteria增加，见图1。从以上分类结果分析，细菌群落的整体差异与这些主要群体(Actinobacteria, Alphaproteobacteria 和Flavobacteria)有关。忽略其他因素影响，多样性除了D35外，其他都相对稳定。本实验研究的多样性指数包括OTUs数量以及Shannon指数。此外多样性与采样时间以及环境因子并不存在显著性相关（r < 0.4，P > 0.5）。图1 各采样时间水样中的优势

15、菌门相对丰度（相对丰度>1%）3.3 细菌群落结构分析尽管在养殖周期群落丰度以及多样性没有明显的改变，通过非度量多维尺度（NMDS）对样品OTUs排序分析，主要在第一象限分开，这可以清楚得出在我们跟踪的虾塘中浮游细菌类群连续性的变化规律。NMDS 轴1与取样时间存在线性显著相关（Pearson相关系数， = 0.961，P <0.001）（见图2b）。这个模式可以用perMANOVA方法进一步说明取样时间对于确定细菌群落的组成起着重要的作用（F = 1.80, P = 0.001）。在连续采样阶段，群落结构并没有发生显著的变化，例如群落结构在D45和D55以及D63和D69之间并没

16、有显著差别，然而D45和D63以及D63和D77之间存在显著的变化（P < 0.05），详见表1。结果表明，在短期内细菌群落在时间尺度上存在动态演替。图2 非度量多维尺度（NMDS）分析注：图a即微生物群落随时间演替；图b即群落结构与采样时间显著正相关。表1 基于非参数多元方差（perMANOVA）分析群落差异性D35-1D45-1D55-1D63-1D69-1D35D450.672D550.0340.069D630.0350.0330.011D690.0330.0340.0040.451D770.0360.0340.0040.0030.073注：加粗值为各采样日期细菌群落存在显著差异性

17、（p < 0.05）。3.4 环境因子与细菌群落的关系利用CCA方差分析筛选出影响微生物群落结构的关键变量，将微生物群落的分类结构和水体性质以及叶绿素a与光合作用相联系。最后筛选出TN（p = 0.001）， PO43- （p = 0.030），碳氮比（p = 0.001），叶绿素a（p = 0.007）4个重要指标，由CCA图知，群落变化和相关变量显著相关（见图3）。群落结构在后期（D63、D77）与前期（D35、D45）是不同的，主要在第一轴分开，与碳氮比和叶绿素a成正相关，与TN和PO43-成负相关（见图3）。图3 各样品与水质参数之间的CCA分析3.5 相似性与时间关系为了评估浮

18、游细菌群落的周转率，实验利用相似性时间的关系（即STRs），来评估在人工养殖对虾池塘整个细菌群落的演替。通过细菌群落相似性和采样时间用log函数转化，并通过线性回归来求出STR斜率。STR显著（p = 0.002），其中指数w = 0.400（见图4）。由此可见，细菌群落的变化趋势是可以预测的，即在监测的各个塘中细菌变化的运动轨迹是相似的（见图5）。此外，累积OTUs和天数存在显著相关（p < 0.001），细菌类群的时间周转率为0.393。图4 细菌群落相似性时间关系（STRs）图5 不同养殖塘水样PCoA分析4 讨论实验最初是为探究细菌群落与对虾发病之间的关系，因此只收集了对虾发病高

19、发期（放苗后58 ± 8d）的水样34。为研究微生物组成时间演替，实验的采样频率相对不严格，然而，实验已经表明采样频率对于整体的周转率影响很小（见图2b）20。高密度对虾养殖会逐渐导致富营养化9，然而浮游细菌群落对于环境微妙的变化极为敏感3。细菌群落随时间存在明显的变化，细菌群落相似性随时间逐渐降低（见图4），然而其多样性维持不变。细菌群落的时间变化与叶绿素a、TN、PO43- 和碳氮比（见图3）是显著相关的，这与特定种群形成的生态龛的原理相一致35。叶绿素a一直作为估算浮游植物数量和生物量的代表值 36，在很大程度上影响了细菌群落结构的时间演替37。相近的采样点的微生物群落的系统发

20、育更为接近2, 20。同样，由细菌群落的变化反映出菌株水平上也存在一定影响，在连续性采样和其他采样点相比，如D45和D55比较、D63和D69比较，均比其他采样点的细菌群落更加相近，见图2。此外，在采样期间平行演替的模式除外，同一天不同池塘之间发现有更多相类似的细菌群落（见图5）。这清楚表明养殖塘中细菌群落结构随时间的变化不是随机的，而是高度可预测的。之后的实验需要验证对虾养殖周期循环的这种方式。研究表明浮游细菌群落总细胞丰度的变化远小于随时间推移群落组成的变化38, 39。随时间推移群落动态演替以及其功能的研究存在两种机制，即“调整方案”和“替代方案”38。本研究为后一种机制，资源环境的连续

21、变化导致不同类群的浮游细菌组合物形成。很多研究表明群落结构决定应对环境变化的代谢响应 40，主要由于细菌群落结构的变化速率和其功能紧密联系，以及微生物组成影响生态变化的进程11, 41。因此，了解细菌的动态演替对于更好的预测生态系统的功能是至关重要的。虾池细菌群落的相似性与时间关系（STRs）指数(w = 0.400)比在多个环境中细菌连续变化的斜率（0.020.03）更大4。这种差异的形成可用以下原因解释，我们利用焦磷酸测序技术，检测到的微生物更加丰富，特别是能检测出一些罕见的物种。尽管我们的测序深度并没有达到饱和，但Shade等4测序深度比我们低的多，每个样品测序深度为4863526bp。

22、相关研究表明，样品群落结构的变化对于测序深度不是特别敏感，例如，每个样品有降噪序列约占90%，进而分析多样性42。另外，在一定程度上斜率可能由于随机过程而变大43, 44，例如对虾养殖过程中每天进排水的影响。尽管这样，类群与时间关系的斜率和在其他环境中细菌类群累积率相似20-22。此外，时间尺度上细菌群落动态演替和环境因子显著相关（图3），可以预测的演替轨迹表明影响因素是可以确定的而不是随机的，其在细菌时间演替方面起决定性作用。按照空间尺度模式，实验总结出相似性与时间关系的曲线（STRs）来评估细菌群落周转率。最近研究表明，随着时间推移环境因子的变化与水生生物空间异质性类似17，即推动群落动态

23、变化与生态过程相类似。其实长期以来，都是将空间代替时间研究微生态演替时序45, 46。然而在假设稳定生物化学因素等方面，这种方法也是饱受争议的46。生态研究需要转变连续物种研究的模式（一般多样性不随时间变化），而去研究多样性，将其作为生态过程研究的基础。总之，这项研究的重要性在于我们提供了说明细菌群落相似性（多样性）而不是累积群落丰度的时间动态演替直接的证据16, 18。这反映了微生物随距离衰减的相似性的模式。尤其在较短的时间内（42d），演替轨迹是可以预见的。浮游细菌群落时间演替是可以高度预测的45, 46，这与地理化学特点是显著相关的46。这对于人为调节维持虾塘生态功能是一个机会也是一个挑

24、战。综上，我们研究出细菌群落结构在空间尺度可以预测的模式，与细菌时空变化的幂次模型类似。参考文献1 Snieszko SF (1974) The effect of environmental stress on outbreaks of infectious diseases of sh. J Fish Biol 6:197208.2 Gilbert JA, Field D, Swift P, Newbold L, Oliver A, Smyth T, et al (2009) The seasonal succession of microbial communities in the W

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