SILAC定量蛋白质组学ppt课件

1、SILAC定量蛋白质组学 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-1663SILAC定量蛋白质组学o1：SILAC定量蛋白质组学原理o2: 运用o 2.1：SILAC定量蛋白质组学o 2.2: SILAC研讨蛋白质相互作用o 2.3：SILAC研讨蛋白质与DNA相互作用o 2.4：SILAC研讨蛋白质与RNA相互作用 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16631 1：SILACSILAC定量蛋白质组学原理定量蛋白质组学原理o1.11.1：SILACSILAC定量蛋白质组学的原理定量蛋白质组学的原理o1.21.2：SILACSILAC技术流程技术流程o

2、1.2.11.2.1：培育基预备：培育基预备o 1.2.21.2.2：细胞标志与测试：细胞标志与测试o 1.2.3: 1.2.3: 实验处置实验处置o 1.2.31.2.3：蛋白质分别与质谱分析：蛋白质分别与质谱分析o 1.2.41.2.4：结果方式：结果方式 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-1663 SILAC法。 1、标志：在缺乏Lys和Arg的培育基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培育细胞，使蛋白质被标志成“中型或“重型； 2、细胞处置，如药物处置； 3、细胞裂解、提取蛋白质； 4、等量混

3、合对照与处置组蛋白质、SDS-PAGE电泳、染色； 5、割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。1.11.1：SILACSILAC定量蛋白质组学原理定量蛋白质组学原理1.11.1：SILACSILAC定量蛋白质组学原理定量蛋白质组学原理 技术优势目前比较蛋白质组学最先进方法 1高效性：SILAC是体内标志技术，标志效率可高达100%； 2定量准确：线性范围广，降低由于样品制备不同而呵斥的实验内差别； 3高通量、灵敏度高：可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质，且检可测测到纳克级程度； 4相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培育基中可以培育的细胞或细菌中表达的蛋白进展标志； 5灵敏性：在

4、缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培育基中添加同位素标志的这两种氨基酸，操作方便。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16631.2.11.2.1：培育基预备：培育基预备资料：资料： 1 1：LysLys或和或和ArgArg缺陷型缺陷型16401640培育基，培育基， Lys Lys或和或和ArgArg缺陷缺陷型型DMEMDMEM培育基。培育基。 2 2：透析：透析FBSFBS。 3 3：稳定同位素标志的：稳定同位素标志的LysLys和和ArgArg。L-Lysine(13C6), L-Lysine L-Lysine(13C6), L-Lysine (13C6,15N2),

5、L-Lysine(13C6,15N2), L-Lysine(15N2,D9), L-(13C6,15N2), L-Lysine(13C6,15N2), L-Lysine(15N2,D9), L-Lysine(4,4,5,5-D4) ,L-Arginine(13C6), L-Arginine (13C6, Lysine(4,4,5,5-D4) ,L-Arginine(13C6), L-Arginine (13C6, 15N4), L-Arginine(13C6,15N4)15N4), L-Arginine(13C6,15N4)。培育基制备：培育基制备： 取相应量的稳定同位素氨基酸取相应量的稳定同

6、位素氨基酸LysLys和和ArgArg各各50mg,50mg,添加到添加到500ml500ml培培育基中，同时添加血清普通是育基中，同时添加血清普通是10%10%和抗生素后，和抗生素后，0.22um0.22um滤膜过滤膜过滤，滤，4 4度保管备用。根据实验的需求，可以配制度保管备用。根据实验的需求，可以配制“中型和中型和“重型重型培育基。培育基。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16631.2.21.2.2：细胞标志与测试：细胞标志与测试标志：标志： 普通细胞经过添加同位素的培育基传代培育普通细胞经过添加同位素的培育基传代培育5-65-6代后，一天或代后，一天或2 2

7、天传代一次，细胞中蛋白质的天传代一次，细胞中蛋白质的LysLys和和ArgArg将被同位素氨基酸取代。将被同位素氨基酸取代。添加了稳定同位素添加了稳定同位素“中或中或“重型的细胞与重型的细胞与“轻型细胞相比轻型细胞相比细胞生长速度能够偏慢，这是由于透析血清与中缺乏一些盐成分，细胞生长速度能够偏慢，这是由于透析血清与中缺乏一些盐成分，可以让透析血清在可以让透析血清在PBSPBS里面透析，透析膜的孔径普通为里面透析，透析膜的孔径普通为10KDa.10KDa.标志测试：标志测试： 在进展正式实验之前，需求对细胞进展标志测试，测试细胞中在进展正式实验之前，需求对细胞进展标志测试，测试细胞中蛋白质的蛋白

8、质的LysLys和或和或ArgArg能否被相应的同位素氨基酸取代。收取能否被相应的同位素氨基酸取代。收取 蛋白质后，等量混合，蛋白质后，等量混合，SDS-PAGESDS-PAGE分别，分别，LC-MS/MSLC-MS/MS检测。检测。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16631.2.21.2.2：细胞标志与测试：细胞标志与测试细胞经过传代培育细胞经过传代培育7 7天后，同一肽段被天后，同一肽段被“重型肽段取代重型肽段取代 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16631.2.3: 1.2.3: 实验处置实验处置 当标志测试检测到蛋白质已被同位素氨基

9、酸标志后，可以进展细胞处置，如药物处置，病毒处置等。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16631.2.31.2.3：蛋白质分别与质谱分析：蛋白质分别与质谱分析o1：提取“轻型，“中型，“重型细胞蛋白质，等量混合，SDS-PAGE分别，染色。o2：割取蛋白质条带，胰蛋白酶酶切。o3：LC-MS/MS仪器：LTQ Orbitrap XL)分析，数据检索。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16631.2.41.2.4：结果方式：结果方式 LC-MS/MS分析结果，将会给出每个肽段的质谱峰图及定量信息。结果将会已EXCEL表格呈现。 肽段质谱峰图及表

10、达量：2: SILAC2: SILAC运用运用o 2.1 2.1：SILACSILAC定量蛋白质组学实例定量蛋白质组学实例o 2.2: SILAC2.2: SILAC研讨蛋白质相互作用研讨蛋白质相互作用o 2.32.3：SILACSILAC研讨蛋白质与研讨蛋白质与DNADNA相互作用相互作用o 2.42.4：SILACSILAC研讨蛋白质与研讨蛋白质与RNARNA相互作用相互作用 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16632.12.1：SILACSILAC定量蛋白质组学实例定量蛋白质组学实例 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16632.1 Sc

11、hematic for SILACSILAC实验流程图2.1 MS spectra showing the four major patterns of phosphorylation observed 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-1663SILAC定量结果图例，质谱峰的高度表示蛋白表达的相对强度. Summary of fold change with Her2 for all 462 proteins, with several individual proteins high-lighted. Proteins with a ratio1.5(upperre

12、d line) are consideredas increased in their tyrosine phosphorylation level,and those with ratios0.66 (lowerred line) are considered as decreased in their tyrosine phosphorylation level. In3T3-Her2cells,198 proteins showed significant increases in phosphorylation,and 81 proteins showed a significant decrease 2.1 Quantification of phosphorylation by SILAC 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16632.1 Conclusion 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16632.2 SILAC2.2 SILAC研讨蛋白质与蛋白质相互作用研讨蛋白质与蛋白质相互作