阴道毛滴虫衰老生物学标志分子β_半乳糖苷酶基因克隆和蛋白表达

1、阴道毛滴虫衰老生物学标志分子_半乳糖苷酶基因克隆和蛋白表达         08-11-29 13:25:00     作者：许铭炎     编辑：studa20【摘要】  目的:克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis, Tv)衰老生物学标志分子_半乳糖苷酶(_gal)同源基因，表达_GAL重组蛋白。方法:从Tv cDNA表达文库中分离获得Tv_gal同源基因的cDNA克隆，测序和序列分析。将cDNA

2、部分片段亚克隆到原核表达载体(pQE_80L)，转化宿主菌E.coli SG13009，异丙基_D_硫代半乳糖苷诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定。结果:在Tv cDNA文库中获得1株2445bp的cDNA克隆。序列分析表明，该序列开放读码框有2415bp，推测肽链具有804个氨基酸,等电点为54；该肽链与多种来源的_GAL同源蛋白均具有较高同源性。用PCR扩增了该cDNA序列中的2277bp片段，构建了pQE_80L/Tv_gal,所表达重组蛋白产物的相对分子质量为82ku。结论:推测该克隆是Tv_gal的同源基因，Tv_gal基因可以在E.coli中得到表达，为进一步研究其细胞内定位和蛋

3、白功能奠定了基础。 【关键词】  阴道毛滴虫 _半乳糖苷酶 cDNA克隆    2Heyuan Entry_Exit Inspection and Quarantine Bureau, Heyuan 517000, China)AbstractObjective：To clone and analyze Trichomonas vaginalis(Tv)_galactosidase(Tv_gal)homology gene , and to express the recombinant protein. Methods：One cDNA clone,

4、with high homology of _gal, was isolated from Tv cDNA library. The cDNA was sequenced and analyzed. Then a fragment of the cDNA was cloned to the expression vector pQE_80L. E.coli SG13009 cell was transformed by the recombinant plasmid. The expression of protein was induced by isopropyithio_D_galact

5、oside. Sodium dodecyl sulfate_polya_crylamide gel electrophoresis analysis was performed to detect the recombinant protein. Results：One cDNA clone with a length of 2 445 bp was isolated. The cDNA clone had an open reading frame with 2 415 bp. The deduced amino acid sequence contains 804 residues and

6、 its isoelectric point is 54. The cDNA clone was high homology to the _gal homologus of different species. A 2 277 bp fragment of the cDNA was amplified by PCR and therecombinant expression plasmid(pQE_80L/Tv _gal)was constructed. The fusion protein of Tv _GAL(about 82 ku)was expressed. Conclusion：T

7、he cDNA clone isolated belongs to _gal homolog. Tv _gal is expressed well in E.coli, which will be helpful for the further study on the location and function of Tv _gal in Tv.    Key WordsTrichomonas vaginalis; _galactosidase; cDNA clone_半乳糖苷酶(_GAL)，广泛存在于各种动物、植物及微生物中。早期只是利用该酶水解乳糖的性质来降

8、低牛乳中的乳糖含量,改善人类对牛乳乳糖的不耐受反应。随着生物技术的发展，对编码该酶的基因结构有了深入地了解，使得该酶不仅在食品工业中的用途越来越广，而且在生物技术领域(基因工程、酶工程、蛋白工程方面)都发挥着重要作用，并广泛用于化学、医药等领域。近年来，发现了一种在衰老细胞中表达的_GAL，而休眠和终末分化的细胞及永生化细胞缺乏或不表达。大多数细胞表达溶酶体_GAL，在pH=4时具有活性1，而衰老细胞中表达的_GAL在pH=6时活性最高，所以该酶可以作为体内鉴别衰老细胞的生物学标志而被广泛应用2。本研究以单细胞真核原生生物阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis， Tv)为模式生

9、物，拟观察_GAL的表达水平是否也能反映单细胞原生生物的衰老变化。初步报道Tv _gal基因的克隆、序列分析和重组蛋白的表达及鉴定。    1材料与方法    11细胞株及其培养Tv LX006细胞株(本实验室保存)取自汕头大学医学院第一附属医院患者。细胞株于改良的TYM(tryptone/yeast extract/maltose)3培养基中(去除其中的麦芽糖成分，增加体积分数10%的小牛血清和质量分数1%的葡萄糖)37恒温传代培养至对数生长晚期约48h，细胞数(48)×106个/mL离心收集细胞(2500r/min，10

10、min);用磷酸盐缓冲液(01mol/L，pH72)洗涤2遍后，提取总RNA和基因组DNA。    12 Tv _gal cDNA克隆我室已构建Tv的cDNA文库4，在分离cDNA克隆和测序的过程中，获得1个与_gal及其同源基因有较高同源性的cDNA克隆，命名为Tv _gal(GenBank accession number:EF107527)。    13Tv _gal基因组DNA及cDNA克隆及鉴定以标准方法5提取Tv细胞基因组DNA，根据Tv _gal cDNA序列，利用DNAman软件设计PCR引物(上游:5_ATCTGGG

11、TATTAAACAATGC_3，下游:5_TTATTTTGATGTCATTGTAA_3)。分别以基因组DNA和cDNA为模板,用PTC_150 PCR仪(MJ研究公司，美国)进行PCR扩增(Clontech PCR试剂盒，美国)。扩增反应条件：94预变性3min，94变性30s，58退火30s，72延伸3min，30个循环；72延伸10min。PCR产物直接亚克隆入质粒(pGEM_T easy,普洛麦格公司，美国)，构建pGEM_T/Tv _gal重组质粒，并转化宿主菌大肠矣希菌(E.coli)JM109，挑取阳性克隆并提取质粒由上海基康生物技术有限公司进行测序鉴定。用相似序列比对工具对基因组

12、DNA和cDNA序列进行比对。14 Tv _GAL序列分析使用在线分析软件Blastp在GenBank数据库中查找同源序列6。在推导的氨基酸序列中查找并标示_GAL家族蛋白酶活性必须的氨基酸残基(Glu_420, Glu_485, Gly_734)。    15进化树分析在GenBank中查找各种不同生物的_GAL及其同源蛋白的氨基酸序列，应用ClastW182(使用默认参数)进行序列比对。用MEGA3软件进行进化树分析7。    16 Tv _GAL重组蛋白的表达    161目的片段准备根据Tv _g

13、al基因开放读码框设计合成引物,扩增开放读码框架内2277bp片段。 引物序列为上游: 5_ATGGATCCGCAGCATTC_AGTAGATCATCAGAT_3， 下游: 5GGCTGCAGAGTC_CCTTAGCAGAAGCCTC_3。在上、下游引物5端分别加入EcoRV和PstI的酶切位点(下划线部分)。以cDNA克隆为模板进行PCR扩增。扩增反应条件同前。质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳分离后，用凝胶回收试剂盒(快而精有限公司，德国)回收纯化目的片段，与pGEM_T easy连接，转化感受态E.coli JM109，挑取阳性克隆并提取质粒进行酶切鉴定后测序。    162 pQE_80L/Tv _gal重组质粒的构建取上述重组载体及pQE_80L(快而精有限公司，德国)分别用EcoRV、PstI(纽英伦生物技术有限公司，美国)进行双酶切，凝胶纯化目的蛋白及载体片段。将pQE_80L与Tv _gal酶切片段在T4连接酶(纽英伦生物技术有限公司，美国)的作用下16连接15h，转化E.coli