第二代DNA测序技术

1、第二代DNA测序技术 神经生物学 张朝政 第二代DNA测序技术包括：Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术 核心思想：边合成边测序 特点：读长短、通量高，成本低、测序快 Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台测序原理：焦磷酸测序法4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应 焦磷酸测序法反应体系：1个特异性的测序引物和单链DNA模板，4种酶混合物（DNA聚合酶、硫酸化酶、荧光素酶、双磷酸酶）和底物混合物（包括APS和荧光素）。焦磷酸测序法原理及步骤 第一步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和

2、DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，发生以下反应 第二步：上一步中生成的PP i和APS在硫酸化酶的催化下生成ATP，ATP可使荧光素酶催化荧光素向氧化荧光素转化，同时产生可见光，光信号强弱与ATP含量成正比，又n（ATP）=n（PP i）=n（加入的dNTP），因此可根据光信号强弱推知加入的dNTP的个数第三步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在双磷酸酶的作用下降解第四步：加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息 （1）DNA文库制备：将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，末端修复后在片段两端加上不同

3、的接头，变性处理回收单链DNA。 （2）体外DNA扩增：454系统采用的是乳化PCR的方法进行扩增。 （3）富集固定：将含有DNA片段的磁珠富集起来，并将这些磁珠置于一种PTP平板中的特制小孔中，每个孔只能容纳一个磁珠。 （4）测序：采用焦磷酸测序法，每个含有磁珠的小孔都可以测出其中一个片段的序列。 Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器 测序原理：类似Sanger测序法，dNTP的3-OH被化学方法所保护，并带有碱基特异荧光标记，因而每次只能添加一个dNTP，放出一个荧光信号。 （1）DNA文库制备：把待测的DNA样本打断成小片段，两端添加上

4、不同的接头，构建出单链DNA文库 （2）体外DNA扩增： （3）测序：加入测序试剂，在合成连结合一个碱基后，洗脱掉游离的dNTP，然后在检测荧光信号后加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3-OH保护基团，以此为一个循环，重复这个循环即可测出该片段序列。 Solid测序技术是第二代基因分析技术中准确度最高的。 测序原理：基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测序。 合成新链所用酶：DNA连接酶 底物：8碱基单链荧光探针混合物3-XXnnnzzz-5，根据XX的不同在探针的5末端分别标记了4种颜色的荧光染料 当荧光探针能够与DNA模板链配对而连接上时，就会 发出代表第1，2位碱基的荧光信号Solid技术测序流程 （1）DNA文库构建：片段打断，并在片段两端加上测序接头，连接载体，构建单链DNA文库。 （2）体外扩增：乳化PCR，磁珠直径约1um，在扩增的同时对扩增产物的3端进行修饰（为后面测序做准备） （3）磁珠富集转至测序玻片 （4）连接法测序454技术Solid技术技术体外PCR扩增方法磁珠乳化PCR（磁珠直径约28um）桥式PCR磁珠乳化PCR（磁珠直径约