叶绿体色素的提取分离定量及理化性质的鉴定

1、 实验日期：2011.9.28叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定1、 实验原理 叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素 a 、叶绿素 b 、胡萝卜素和叶黄素组成。它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。1. 叶绿体色素的结构与分离叶绿素a为蓝黑色固体，在乙醇溶液中呈蓝绿色；叶绿素b为暗绿色，其乙醇溶液呈黄绿色。Chla与Chlb是吡咯衍生物与镁的络合物，它们很相似，不同之处仅在于Chla第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。 Chla与Chlb 是植物进行光合作用必需的催化剂，易溶于石油醚等非极性溶剂中。

2、通常植物中叶绿素a的含量是叶绿素b的三倍。其结构式如下： 类胡萝卜素是一种橙色的天然色素，属于四萜，为一长链共轭多烯，有、三种异构体，其中异构体含量最多。-胡萝卜素(R=H)和叶黄素(R=OH)叶黄素是一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体内，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在石油醚中溶解度较小。秋天，高等植物的叶绿素被破坏后，叶黄素的颜色就显示出来。叶绿素与类胡萝卜素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不

3、同，经过一定时间后，可将各种色素分开。 2. 叶绿体色素的物理性质 叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它从第一单线态返回基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。因为分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部的振动上，发射的荧光的波长总是比被吸收光的波长要长。3. 叶绿体色素的化学性质叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。在酸性条件下，卟啉环中央的镁离子可以被H+ 取代，产生褐色的去镁叶绿素。叶绿素中的Mg2+也可以被其它金属离

4、子，如Cu2+ 或Zn2+ 等取代，此时叶绿素仍保持绿色。叶绿素是一种二羧酸叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。根据朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，某有色溶液的吸光度A值与其中溶质浓度C以及光径L成正比，即AaCL（a为该物质的吸光系数）。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下的吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素提取液中叶绿素

5、a、b含量，只需测定该提取液在2 个特定波长下的吸光度度值，并根据叶绿素a与b在该波长下的吸光系数即可求出各自的浓度。在测定叶绿素a、b含量时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素a、b的80 丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm 和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04 和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式： (1) A663=82.04Ca +9.27Cb (2) A645=16.75Ca+45.6Cb 式中A663、A664分

6、别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的吸光度值；Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(g/L)。 解联立方程(1)、(2)可得以下方程： (3) (4) 如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，(3)、(4)式则可改写为： (5) (6) 叶绿素总量 (7) CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663 叶绿素总量也可根据下式求导 A652=34.5×CT 由于652nm为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)，两者有相同的比吸收系数（均为 34.5 ），因此也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）求出叶绿素总量： CT(g/L)=A652

7、/34.5 CT(mg/L)=A652×1000/34.5 (8) 因此，可利用(5)、(6)式可分别计算叶绿素a与b含量，利用(7)式或(8)式可计算叶绿素总量。2、 实验目的1、掌握提取和分离叶绿体色素的方法；2、掌握测定叶绿体色素含量的方法；3、熟悉叶绿体色素的理化性质及吸光特性；4、了解植物叶绿体色素组成及其与生境的相关性。3、 实验材料与仪器1、材料：菠菜叶和玉米叶。2、100%丙醇，80%丙醇，的盐酸水溶液，甲醇溶液，乙醚，四氯化碳，碳酸钙粉末，醋酸铜晶体，石英砂。3、分析天平，研钵，漏斗，剪刀，点样毛细管，层析缸，滤纸，试管，试管架，水浴锅，移液枪。4、 实验步骤（一）

8、叶绿体色素的提取、定量1、称取新鲜菠菜叶片2.0g左右，放入研钵中，加5 ml丙酮和少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆。2、再加入5 ml丙酮，并搅拌均匀，用滤纸过滤，由于丙酮易挥发，最后定容至10ml。即为色素提取液，放于暗处备用。3、取0.1 ml色素提取液，用80丙酮稀释到3 ml ，测定663、645 nm 处的吸光值，根据公式计算叶绿素a、叶绿素b的含量。4、测定步骤3中的溶液在400nm到700nm之间的吸光值，每隔10nm测一次，制成菠菜叶绿体色素提取液的吸收光谱。5、称取玉米叶片0.2g左右，重复上述步骤1-3，唯一不同的是我们取了0.3ml玉米色素提取液稀释为3ml。（二）叶绿体

9、色素的分离1、取圆形定性滤纸一张，用毛细管吸取叶绿体色素提取滴在圆形滤纸中心，使色素扩散的宽度限制在0.5 cm以内，保证叶绿素扩展速度均匀,保证色素扩展清晰，风干后，应多点样几次，大约20次左右。2、在圆形滤纸中心戳一圆形小孔（直径约3mm），将纸捻一端插入圆形滤纸的小孔中，使与滤纸刚刚平齐（勿突出）。培养皿中加入适量的四氯化碳，把带有纸捻的圆形滤纸平放在培养皿上，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿。此时，推动剂借毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，不久即可看到各种色素的同心圆环。所用培养皿底、盖直径应相同，且应略小于滤纸直径，以便将滤纸架在培养皿边缘上。3、长形

10、滤纸一条，也点样后层析分离。长形滤纸放入盛有四氯化碳大试管中，进行层析后获得线形不同色素条带，分别剪下后测定吸收光谱。（三）叶绿体色素的理化性质1、叶绿素的荧光现象：取叶绿体色素提取液少许于1支试管中，用反射光和透射光观察提取液的颜色有何不同，反射光下观察到的提取液颜色即为叶绿素产生的荧光颜色。2、光对叶绿素的破坏作用：取叶绿体色素提取液少许，分装两支试管中，一支放在黑暗处（或用黑纸套包裹），另一支放在强光下（阳光下），经过2-3h后，观察两支试管中溶液的颜色有何不同。3、铜代反应：取上述色素提取液少许于试管中，一滴一滴加浓盐酸，直至溶液颜色出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。

11、然后加醋酸铜晶体少许，慢慢加热溶液，则又产生鲜亮的绿色。此即形成了铜代叶绿素。4、 皂化反应：取叶绿体色素提取液2 mL于大试管中，加入4mL乙醚，摇匀，再沿试管壁慢慢加人3mL蒸馏水，轻轻混匀，静置片刻，溶液即分为两层，色素已全部转入上层乙醚中。用滴管吸取上层绿色层溶液，放入另一试管中，再用蒸馏水冲洗一、二次。在色素乙醚溶液中加入30KOH甲醇溶液，充分摇匀，再加入蒸馏水约3-5 mL，摇匀静置。5、 结果1. 叶绿素含量及对比表一 菠菜与玉米叶绿素的含量及对比项目菠菜叶玉米叶称取量/g2.00900.2090稀释倍数3010OD6450.1630.053OD6630.4050.173Ca=

12、12.7OD663-2.69OD645（g /ml）4.7052.055Cb=22.9OD645-4.68OD663 (g /ml）1.8370.404Ct=Ca+Cb=20.2D645+8.02D663（g /ml）6.5412.458Chla含量（g /g）702.588983.254Chlb含量（g /g）224.316233.301ChlT含量（g /g）976.6551176.077 光合作用时CO2中的C直接转移到C3(3-磷酸甘油酸)里的植物叫做C3植物，菠菜为C3植物；光合作用时CO2中的C首先转移到C4（草酰乙酸）里，然后再转移到C3中的植物叫做C4植物，玉米为C4植物。两类

13、植物在叶绿体的结构及分布上不同，C3植物的维管束不含叶绿体，叶脉颜色较浅；C4植物的维管束含叶绿体，叶脉绿色较深有呈“花环型”的两圈细胞。C4植物叶肉细胞的叶绿体固定CO2的酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC与CO2的亲和力强于C3植物叶绿体内固定CO2的酶。 C4植物将CO2泵入维管束鞘细胞，改变了CO2/O2比率，改变了Rubisico（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶）的作用方向，降低了光呼吸。故C4植物比C3植物具有更强的光合作用。 从表一中可以看出， 玉米的叶绿素a和叶绿素b含量都比菠菜的叶绿素a和叶绿素b含量都要高，玉米叶片中叶绿素总含量为1176.077g /g，ab值为4.6；菠菜叶片

14、的叶绿素总含量比玉米低，只有976.655g /g，ab值为2.9，也比玉米低，但叶绿素b含量与玉米相近。由此可见，叶绿素含量的高低及其ab比值的大小在一定程度上也影响光合速率的大小。玉米叶片的叶绿素含量较高，其单位叶面积的叶绿素数目最多，因而光合速率大，这可能是导致玉米光合速率较高的因素之一。2. 叶绿体色素的分离及其吸收光谱1) 圆形滤纸层析分析 在滤纸上可清楚地看到蓝绿色的叶绿素a，黄绿色的叶绿素b，黄色的叶黄素和橙黄色的胡萝卜素，但叶黄素和胡萝卜素长时间放置后无法看清。叶绿素a第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代后为叶绿素b； 类胡萝卜素属于四萜，为一长链共轭多

15、烯，-胡萝卜素的两个-H被-OH取代后为叶黄素。叶绿体色素的极性按从大到小排列分别是：叶绿素b>叶绿素a>叶黄素>胡萝卜素根据相似相溶原理，在有机溶液中的溶解度： 叶绿素b<叶绿素a <叶黄素<胡萝卜素，故极性越大，在展开剂中移动的速度越慢，所以滤纸上从外到内的四个色素带圈分别是胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b。 由上图可以看出，菠菜叶片中叶绿体色素含量从高到低依次为叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素。并且可以看到叶绿素a分别在大约430nm和663nm处具有两个吸收峰，它在红光区的吸收带偏向长波方面，吸收带较宽，吸收峰交高，而在蓝紫光区的吸收带偏向短

16、光波方面，吸收峰较窄，吸收峰较低；而叶绿素b的吸收峰位于460nm和650nm附近。理论上，叶绿素a在红光区的吸收峰比叶绿素b的高，蓝紫光区的吸收峰咋比叶绿素b的低，但从上图看，叶绿素a在蓝紫光区的吸收峰咋比叶绿素b的高，可能原因是菠菜的叶绿素a含量高，a/b为2.9，叶绿素b的吸收峰被掩盖在叶绿素a的430nm强峰之下。由上知叶绿素吸收光谱的最强吸收区是波长640-660nm左右的红光区和430-450nm左右的蓝紫光区，叶绿素对橙光、黄光吸收较少，尤其对绿光吸收最少；叶黄素和胡萝卜素在较短的波长处（400-500nm）之间的吸收值较高，而对波长大于500nm的光吸收值接近为零，故类胡萝卜素

17、的最大吸收带在400-500nm的蓝紫光部分，而且在蓝紫光部分吸收的范围比叶绿素宽一些，因而呈现黄色。叶绿体色素之所以要选择吸收光谱是长期进化中形成的对生态环境的适应，叶绿素吸收光实质是吸收光子，叶绿素吸收光子后，其电子从基态跃迁到激发态，叶绿素a能从水中获取电子导致水的分解，只有振动频率能与电子共振的光子且能满足电子跃迁的能量要求，才能被叶绿体色素吸收。3. 叶绿体色素理化性质实验现象及分析1) 荧光反应：现象：用透射光观察色素提取液为绿色，用反射光观察则为深红色（叶绿素 a为血红光，叶绿素b为棕红光）透射光下反射光下分析：叶绿素吸收光谱的最强吸收区是波长640-660nm左右的红光区和43

18、0-450nm左右的蓝紫光区，叶绿素对橙光、黄光吸收较少，尤其对绿光吸收最少，所以用透射光观察色素提取液时看到绿色；产生红色反射光是因为荧光现象，它产生的原因如下：光具有波粒二象性，对光合作用有效的可见光的波长是在400700 nm之间，同时光又是一粒一粒地运动着的粒子流，每一粒子叫一个光子，光子所具有的能量，叫做光量子。光子携带的能量与光的波长成反比。每摩尔光量子具有的能量如下：E=N h=Nhc/式中E为能量（千卡），N为阿伏加德罗常数（6.02×1023），h为普朗克常数（6.6262×10-34JS），为频率（s-1），c是光速（2.9979×108m s

19、-1），是波长（nm）。每摩尔光量子的能量通常是以千卡或爱因斯坦来表示。当叶绿素分子吸收光量子后，就由低能级的基态提高到了一个高能级的激发态。根据波尔（Bohr）理论，电子从近核低能轨道跃到远核高能轨道上为激发态（第一、二单线态），激发态的叶绿体分子极不稳定，又迅速由激发态恢复到基态，同时向空间发射光子，称为荧光。恒温下，荧光的光子要比吸收的光子能量低，所以放出的波长更长、颜色更红些，因而使叶绿素溶液在入射光下呈绿色，而在反射光下呈红色。叶绿素的荧光现象说明叶绿素能被光所激发，而叶绿素分子的激发是其能将光能转变为化学能的前提。在整体植物中，叶绿素所吸收的光能被用于光合作用，因此看不到荧光现象。

20、当荧光出现后，立即中断光源，色素分子仍能持续短时间的放出“余辉”，称磷光现象。这种现象的原因是处于第一单线态的激发态的叶绿素分子，先以热能的形式丢失掉一部能量，转为一种亚稳定态（第一三线态），从亚稳定态回到基态时放出的光子便为磷光，其寿命比荧光长（荧光为10-9s，磷光为10-310-2s），但比荧光弱。 2) 光破坏： 现象：培养箱中光照2h后色素提取液呈黄褐色，而暗室中提取液仍为绿色。黑暗处强光下分析：参考中科院植物研究所的光逆境对叶绿体叶绿素蛋白质复合物的影响知，强光照射对菠菜叶绿体的叶绿素蛋白质复合物会产生一些光合特性的影响。实验结果表明，随着强光照射时间的延长，首先，属光系统核心的叶

21、绿素蛋白质复合物的CPa带明显减少了，进而属LHCII的寡聚体和二聚体的带有了不同程度的降低，最后，包括光系统I在内的叶绿素蛋白质复合物带大部分被分解了。结果还表明，当光逆境还未使叶绿素蛋白质复合物发生明显变化时，代表光系统活性的Fv/Fo值及DCIP光还原活性就已显著地降低了。强光照射对菠菜叶绿体中叶绿素含量及chla/b也有一定影响，菠菜叶绿体随着强光照射时间的延长，叶绿素含量明显下降，照光7小时的叶绿体，其叶绿素含量下降高达一半，且chla比chlb更易被破坏。强光照射首先使光系统反应中心受到损伤，其活性大大降低；叶绿素蛋白质复合物的减少主要是由于进一步的光氧化造成的，因为叶绿素的化学性

22、质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，植物体内本来有还原酶，可以破坏光产生的强氧化物质。而叶绿素离体后，无法被分解的强氧化物质会破坏不稳定的叶绿素，它的吸光度在663nm（绿光）下会变大的，而类胡萝卜素则较稳定，故强光照射后提取液呈黄褐色。3) 铜代反应： 现象：滴加浓盐酸后溶液呈黄褐色，加入醋酸铜晶体并水浴加热后溶液变绿 加入醋酸铜晶体并水浴加热加入浓盐 酸分析：加入浓盐酸后，叶绿素卟啉环中心的Mg离子被氢离子取代，生成褐绿色的去镁叶绿素；再向溶液中加入醋酸铜晶体并水浴加热后，铜离子取代卟啉环中心的氢离子而生成绿色的铜代叶绿素，它稳定而不易降解，故常用醋酸铜

23、处理来保存绿色植物标本4) 皂化反应： 现象：加30%KOH-甲醇后溶液变深褐色，加水摇动后，溶液分为两层，上层呈黄色， 下层呈绿色。分析：分层后的溶液上层为乙醚层，下层为水层。叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶绿醇酯化。叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。叶绿素的盐形成以后，因分子极性增大，易溶于水中，不能进入乙醚层；而类胡萝卜素在乙醚层中的溶解度大于在水中的溶解度，故上层的乙醚层中含未发生反应的易溶于有机溶剂的叶黄素和胡萝卜素，呈黄色；下层的水中溶有叶绿酸的盐，呈绿色。六、注意事项 1. 提取 本实验色素存在于绿色植物叶肉细胞的叶绿体中，且具有脂溶性。因此，选择的材料应是叶肉细胞（幼嫩、色浓绿的叶片）。为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行： 剪：叶片要新鲜、颜色要深绿，越细越好，尽量去除叶脉等部分。 加药品：二氧化硅、碳酸钙和丙酮。二氧化硅的作用是使研磨更加充分、迅速；碳酸钙的作用是调节液体的pH，防止叶绿素被破坏保护叶