营养因子对铁皮石斛幼苗生长的影响

1、基金项目:国家杰出青年科学基金资助项目(30325047作者简介:孟志霞,女,助理研究员,硕士 *通讯作者:郭顺星,男,研究员,博士生导师 Te:l (01062829619 E-m ai:l sxguo2006ya -hoo .co 营养因子对铁皮石斛幼苗生长的影响孟志霞,房慧勇,郭顺星*,陈晓梅,肖培根(中国医学科学院-中国协和医科大学药用植物研究所,北京100094摘要:目的 研究营养因子对铁皮石斛(D endrobiu m cand i du m W all 1Ex L ind1幼苗生长的影响。方法 以铁皮石斛幼苗为外植体,以培养一个周期后的生物量、分蘖数或生根数为指标,采用单因素实验

2、分别考察不同培养基、碳源种类、氮源总浓度及两种形态氮素配比和活性炭添加量5组因子对幼苗生长的影响,对生物量的统计学处理采用单因素方差分析和q 检验。结果 在幼苗生长过程中,20%马铃薯汁可显著促进植株分蘖形成,1/2M S(大量元素减半+20%马铃薯汁是铁皮石斛幼苗分蘖和生长的适宜培养基。除乳糖外,30g #L -1蔗糖和葡萄糖均适合幼苗生长,且对其生物量的影响无显著差异。培养基中氮源浓度过高抑制幼苗的生长,氮源以30mm o l #L -1总氮量,NH +4/NO -3的比例为0B 3或1B 2较适宜幼苗生长。培养基中3g #L -1的活性炭可使试管苗每株生根数提高为对照的3126倍,使干重

3、显著提高(P 0105,且生长健壮。结论 适宜的营养条件可使铁皮石斛幼苗的分蘖增殖培养与生根壮苗培养在同一种培养基上一步完成。关键词:营养因子;铁皮石斛幼苗;培养基;碳源;氮源;活性炭;分蘖;生物量中图分类号:S567 文献标识码:A 文章编号:1001-2494(200809-0665-04Effects of Nutritional Factors on t he Grow t h of D endrobiu m candi d u m SeedlingsM ENG Zh-i x i a ,F ANG H u-i yong ,GUO Shun -x i n g *,C HEN X iao

4、-m e,i X IAO Pe-i gen (Instit ute of M edicinal P lant D evel -opm ent ,Chinese A cade my of M edical Sciences and Pek ing Un i on M edical Colle ge ,B eijing 100094,Ch i naAB STRACT :OB J ECT I VET o i nvesti ga te the e ffects o f nutr i tiona l factors on t he gro w th o f D endrobiu m cand i du

5、m seed -li ng s 1M ETHODS D endrobiu m cand i du m seedli ngs were used as exp l ants ,t he si ng le factor desi gn w as app lied t o esti m ate t he effects o f var i ous fac t o rs i nclud i ng cu lt ure med i u m,ca rbon source ,n itrogen source and active carbon on the grow th o f D endrob i u m

6、 cand i du m seed lings ,w ith its b i omass ,till e r number or average roo t number as i ndex 1The data of b i om ass were analyzed w ith O ne -w ay ANOVA and q test 1RESULTS A s for seedli ng grow th ,20%potato juice si gn ifican tly promo ted the till er f o r m ati on o f the in v itro p l antl

7、 e ts ,the suitable cu lture m ed i u m for seed li ng to till er and gro w th w as 1/2M S (half o f m acro -e le m entssupple m ented w ith 20%potato j u i ce 1Carbon source test i ndicated no sign ifi cant difference i n t he b i omass and g row th of seedli ng s bet w een sucrose and glucose exce

8、pt l ac -tose 1N itrog en source results show ed that the s u itable n itrogen concentration f o r t he grow th w as 30mm o l #L -11the best ratio o f a mm o -n i u m to n itrate we re 0B 3o r 1B 2,wh ile ex cessi ve concentration o f n itrog en source inh i bited seedli ng g row th 1T he concentrat

9、i on o f acti v e ca rbon added i n the m ed i u m w as 3g #L -1,w hich not only i ncreased si gnificantly the dry we i ght of t h is p l ant(P 0105but also m ade the average nu mber o f roo ts per p lantlet i ncrease to 3126ti m es co m pari ng w it h the contro ,l furt her m ore t he p l antl e ts

10、 g rew hea lthy and strong 1CONCLU SI ON T iller propagati on ,roo ting and g row th -pro m oti ng o f D endrob i um cand i du m seedli ng s could be carried out in the sa m e med i u m under su itab l e nu tritiona l cond iti ons 1K EY W ORDS :nu tritiona l factors ;D endrobiu m cand i du m seedli

11、ngs ;cu lture m ediu m;carbon source ;n itrogen sou rce ;active ca rbon ;til-l e r ;b i om ass铁皮石斛(D endrobiu m candidum W all 1Ex L i n d l 1是兰科石斛属多年生附生型草本植物,生于海拔21002500m 的林中树上或林缘岩石上,并常与苔藓植物伴生,在我国主要分布于广西、云南、贵州等地1。铁皮石斛是2005年版5中国药典6收录的3种石斛原植物之一2,是石斛药材中最珍贵品种,具有滋阴清热、养胃生津、润肺止咳等功效3,它所含的多糖类成分具有增强人体免疫功能、防

12、癌抗癌、恢复嗓音等显著功效1。由于大量采挖,近年来铁皮石斛野生资源逐年减少并处于濒危状态,已被国家列为重点保护的野生药材品种。另外,由于铁皮石斛人工栽培繁殖力低等缘故,使其产量与质量的提高也受到较大限制。用组织培养的方法可以实现铁皮石斛的工厂化生产,有关这方面的研究国内已有许多文献发表4,但大多是在影响其种子萌发、原球茎生长及壮苗因素等方面取得了一定的进展,并在简化培养基及降低生产成本方面进行了探索。但未见有以铁皮石斛无菌幼苗为外植体进行规模化扩繁的报道。在试管苗阶段,铁皮石斛幼苗生长缓慢,制约了生产速度,加大了生产成本。本实验以铁皮石斛幼苗为外植体,研究在其分蘖扩繁过程中培养基种类、碳源、氮

13、源、不同形态氮素配比、活性炭等营养因子对其生长的影响,为铁皮石斛产业化生产提供可行性依据。1材料与方法111材料无菌培养诱导茎节腋芽萌发和增殖获得的完整小植株作为本实验的材料,接种时铁皮石斛幼苗高约2c m、含12个节、34片叶、12条不定根。112方法11211培养基对幼苗生长和分蘖形成的影响实验共5种供试培养基,分别为培养基A:MS培养基;培养基B:M S培养基大量元素减半;培养基C:B5培养基;培养基D:67-V培养基;培养基E:M S培养基大量元素减半。除培养基E作对照不添加马铃薯汁以外,其余4种均添加20%马铃薯汁,5种培养基均加入蔗糖30g#L-1,琼脂810g#L-1,p H51

14、8。观察培养过程中幼苗在5种培养基上生长及分蘖情况。11212活性炭浓度对幼苗生长和根系形成的影响实验培养基为1/2M S(大量元素减半+20%马铃薯汁+30g#L-1蔗糖。以不添加活性炭为对照,质量浓度分别为1,2,3,5g#L-1。11213碳源对幼苗生长的影响实验培养基为1/ 2M S(大量元素减半+20%马铃薯汁+2g#L-1活性炭,碳原分别采用蔗糖、葡萄糖和乳糖,质量浓度均为30g#L-1。11214氮源浓度及配比对幼苗生长的影响实验5在去除KNO3与NH4NO3的1/2M S(大量元素减半+20%马铃薯汁+30g#L-1蔗糖+2g#L-1活性炭培养基上,添加(NH42SO4与KNO

15、3分别作为铵态氮和硝态氮供试的唯一氮源。方法一:固定铵态氮和硝态氮比例为1B2,调节总氮浓度分别为6,15, 30,60,90mm o l#L-1;方法二:在总氮浓度为30 mmo l#L-1水平下,调节铵态氮和硝态氮比例分别为0B3,1B2,1B1,2B1和3B0。11215培养条件和实验指标的测定以上4组实验中培养基均添加8g#L-1琼脂,p H518。每个250mL锥形瓶装固体培养基60mL,每瓶接种3株幼苗,接种量017019g,接种量间无显著差异。各组每个处理重复6次。培养温度(23?2e,光照强度15002000lx,光照时间1012h#d-1,所有处理组均于培养的第16周收获,将

16、收获的铁皮石斛苗除去培养基,以瓶为单位称量并记录苗的鲜重,统计单株分蘖数(指在一个培养周期内平均每转接1株幼苗可形成的分蘖数、每株平均生根数和根的生长情况等。收获的铁皮石斛苗50e干燥恒重后,以瓶为单位称量并记录苗的干重,根据每瓶苗的鲜重和干重计算铁皮石斛组培苗的折干率,各处理取平均值。11216统计学处理对铁皮石斛的鲜重、干重和折干率进行单因素方差分析,如果F检验各均数间存在显著或极显著差异,再对各均数以q检验(Ne w-m an-Keu ls检验进行多重比较,结果以/均值?标准差0(x?s的形式表示6。2结果211不同培养基对铁皮石斛幼苗分蘖和生长的影响在不同培养基上,铁皮石斛幼苗(含12

17、条根的茎基部节处都可分蘖繁殖不断生出新的植株成丛生长。培养至16周时,各培养基中新分蘖的幼苗大多含46片叶、34个节、118315c m高、每株平均根数12条。从植株的生长势来看,A和B培养基中幼苗长势明显好于其余3种培养基,植株叶色碧绿,生长健壮,根绿色或白色,B培养基中原接种幼苗平均每株可分蘖新植株7122株,是5种培养基中平均单株分蘖数最高的一种;C培养基上植株叶色绿,茎粗一般,根细、绿色;D培养基上植株叶色浓绿,茎较粗,根绿色;E培养基上植株色泽较深、叶墨绿色无光泽,生长一般,根绿色或白色。A、B、C和D4种培养基中原接种幼苗的单株分蘖数都高于E培养基,表明在培养基中添加20%马铃薯汁

18、可促进幼苗的生长和分蘖形成,这从B和E培养基中单株分蘖数的比较也可以看出,添加马铃薯汁的1/2M S培养基是对照1/2MS培养基的2193倍。见表1。表1不同培养基对铁皮石斛幼苗分蘖和生长的影响T ab11Effects o f d ifferent cu lture med i u m on t he tiller and gro w th of D1candidu m seedli ngsGroup Cult ure m edi umT ill er numberpe r pl antletP la nt he i g h t/c mRoo t nu m berPe r pl antlet

19、A M S41692103100193B1/2M S71222153151119C B541781182151119D67-V31581182151189E1/2M S(CK2146117-2131189212活性炭对铁皮石斛幼苗生根和生长的影响活性炭在诱导某些植物生根方面具有非常明显的作用7。幼苗根系的形成及根的生长与培养基中活性炭浓度密切相关。当培养基中不添加活性炭时,平均每株形成根数相对较少,不足1条。随培养基中添加活性炭浓度的提高(15g#L-1,新分蘖植株平均每株生根数也相应增加。当活性炭浓度最高达5g#L-1时,平均株根数最多为4149条,是对照组的5110倍,新生根数量虽多且粗壮

20、,但根生长较慢,平均根长只有约3c m,而其他3组处理中以2和3g#L-1浓度作用下幼苗的根生长最快,根长平均可达7c m。与对照组相比,活性炭的不同浓度对幼苗生物量的影响不同,培养基中5g#L-1的活性炭可极显著提高组培苗的鲜重(P0101,提高了3113倍;可极显著提高组培苗的干重(P0101,提高了3165倍。培养基中3g#L-1的活性炭可显著提高组培苗的鲜重(P0105,提高了2149倍;可显著提高组培苗的干重(P0105,提高了2137倍。5组处理之间对铁皮石斛幼苗的折干率无显著影响。见表2。表2活性炭对铁皮石斛幼苗生根和生长的影响1n=6,x? sTab12E ffects o f

21、 acti ve carbon on t he roo ti ng and gro w th o f D1candi du m seedli ngs1n=6, x?sConcent rati on /g#L-1Fresh we i ght/g#f lask-1Dry wei ght/g#fl ask-1Dry wei ghtc oe ff ici en/%Root nu m berper pl antl et051181?0141001483?010*?012770188191714?0187601832?010*?0147111132101059?0192801919?010*?018132

22、1383121877?11411111145?01072181843?0187621875161198?11473211761?011312111304?110624149注:与对照组比较,1P0105,2P0101No t e:v s c ont ro l g ro up,1P0105,2P0101213不同碳源对铁皮石斛幼苗生长的影响3种碳源对铁皮石斛幼苗生物量的影响有极显著差异(P0101(表3。多重比较结果表明,蔗糖和葡萄糖中生长的组培苗其鲜重和干重都极显著高于乳糖(P0101,折干率都显著低于乳糖(P 0105。蔗糖和葡萄糖两者在生物量和折干率上均无显著性差异,这表明,除乳糖外,蔗糖

23、和葡萄糖在浓度为30g#L-1时均适合组培苗生长。而乳糖中的组培苗在培养16周后纤细、矮小,叶片不舒展,根系不发达,生长缓慢,平均仅增高约0176c m。葡萄糖中植株比较健壮、群体整齐,根绿色、较发达,平均增高约315c m。蔗糖中植株健壮,生长速度最快,平均增高约416c m。表3不同碳源对铁皮石斛幼苗生长的影响1n=6,x?sT ab13E ffects of d iffe rent carbon source on t he grow t h o f D1 candidum seed li ngs1n=6,x?sCa r bonsourceF resh w ei ght/g#fl ask

24、-1D ry wei ght/g#fl ask-1D ry w ei ghtCo effi c i ent/%G l ucose91050?11122101791?01038181876?017511Sucro se101059?01930101920?01052191081?117341La ct ose11955?0158701213?010*?11006注:与乳糖比较,1P0101N ote:co m pare d w it h t he l actose,1P1B21B12B1m3B0。当培养基中氮源全部为硝态氮时(0B3,组培苗生长健壮,生物量增长最快,培养物中干物质累积也较快,干重

25、达每瓶11006g;1B2时次之,干重达每瓶01871g;随比值继续加大即培养基中铵态氮比例增大硝态氮比例减少,组培苗的生长速度减慢;当培养基中氮源全部为铵态氮时(3B0,组培苗生长受到明显的抑制,表现为,原接种幼苗中有少量植株死亡,存活的幼苗中有部分植株未见明显生长,植株分蘖数少,叶片容易黄化、脱落,根系不发达。方差分析和q检验表明,在折干率上,3B0与1B2两组间有极显著差异(P 0101,0B3组比1B2组显著提高了折干率(P 0105,提高1517%。以上结果表明,在培养基总氮量30mm o l#L-1的水平下,硝态氮(NO-3的相对含量高有利于组培苗生长,铵态氮(NH+4的相对含量高

26、抑制组培苗的生长。见表5。表5不同氮素比值对铁皮石斛幼苗生长的影响1n=6,x?sTab15Effects o f different ratio o f NH+4to NO-3on t he gro w tho f D1cand i du m seed lings1n=6,x?sNH+4/NO-3F resh w ei ght/g#fl a sk-1Dry wei ght/g#fl ask-1Dry wei ghtcoe f f i cie nt/%T il ler num berper pla ntlet0B3111687?1145611006?0114381695?01466141841

27、B2111339?1173901871?010*?0167051171B181536?0194301731?010*?0189231612B181425?0175101770?0118191083?014812153B031554?0136701351?010*?0140722117注:与1B2比较,1P0105,2P0101No t e:vs1B2group,1P0105,2P01013讨论在自然条件下,铁皮石斛有性繁殖极为困难,主要靠根部无性分蘖繁殖不断生出新的植株成丛生长,有时也从上部茎节处生根长出新植株1。本实验根据自然条件下野生铁皮石斛可分蘖繁殖的生长发育习性,在组织培养中以无菌的幼

28、小植株为外植体进行分蘖扩繁,并通过单因素实验分别从几种营养因子中初步筛选出了适宜其生长、分蘖和生根的营养条件。在这些适宜的营养因子作用下,可在同一种培养基上,使铁皮石斛幼苗的分蘖增殖与生根壮苗等过程一步完成,短期内扩繁出数倍生长健壮的完整植株。这与以往组培中常见的无性繁殖程序相比,在缩短繁殖周期的同时也降低了生产成本。另外,本实验只是研究了部分影响因子,有关其他因子对幼苗生长及对组培苗品质的影响还有待深入研究。本实验的研究为铁皮石斛的组织培养和产业化生产提供了一种可参考的途径。REFERENCE S1RAN M X1Dend robium(石斛M1Beiji ng:S ci en tifi c

29、 andTechn i cal Docum en ts Pub lis h i ng H ouse,2002:1312Ch1P(2005Vol(中国药典2005年版1一部S12005:62-6313XU H,WANG Z T,D I NG J Y,e t al1G eneral research aspect ofb i otechnology about m ed i cal Dendrob iiJ1Ch i n W il d P lant R e-sour(中国野生植物资源,2001,20(1:1-414Z HANG Q F,MAO B Z1S t ud ies on i ndustri

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31、n ol:Na tS ci(合肥工业大学学报:自然科学版,2004,27(1:53-5716Z HANG Q,ZHANG Q N1B iostatistics(生物统计学M1B eiji ng:Ch i na Agricu l turalUn i versit y Pub li cati on H ouse,200217LI U G L,L I ANG Z H,Z HU J1E ffects of acti vat ed charcoal onp l an t tiss ue cultures:a revi e wJ1J Ji ang su F orest S ci T e chnol(江苏林业科技,2001,28(5:46-4818W U S P,ZHANG X J,W U C,et al1E ffects of d iffe