利用染色质免疫共沉淀技术确定转录因子RIN调控的靶基因_图文

1、·研究报告·2011年第12期生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN收稿日期：2011-05-12基金项目：国家自然科学基金资助项目（30871741, 30972037）作者简介：李玲，女，博士研究生，研究方向：食品生物技术；E -mail:liling19820925通讯作者：朱本忠，男，副教授，博士，研究方向：食品生物技术；E -mail:cauzbz利用染色质免疫共沉淀技术确定转录因子RIN调控的靶基因李玲1 傅达奇2 朱毅2 田慧琴2 罗云波2 朱本忠2（1天津农学院食品科学系，天津 300384；2中国农业大学食品科学与营养工程学院 食品生物技

2、术实验室，北京 100083）摘 要: 以粉红期番茄果实为材料，用含不同浓度甲醛的缓冲液交联DNA 和蛋白质，利用超声波将其染色质随机断裂成大小为200-1 000 bp的片段，用RIN 蛋白的特异性抗体免疫沉淀与RIN 蛋白结合的DNA 片段，然后解交联和纯化DNA 片段，最终用普通PCR 试验和测序验证与转录因子RIN 结合的DNA 序列。结果表明，适用于番茄果实的最佳ChIP 试验条件为：用1%甲醛溶液交联DNA 和蛋白质的复合物；用20%功率，工作6 s，间隔10 s，脉冲3次超声破碎该复合物，可以得到适当大小的片段，用于后续的试验。普通PCR 和测序验证结果证明转录因子RIN 与Le

3、ACS2和LeACS4启动子区域的CArG box序列结合。关键词: 染色质免疫共沉淀技术 转录因子RIN L eACS2基因 L eACS4基因 番茄果实Determining the Target Genes of RIN Transcription Factor byChromatin ImmunoprecipitationLi Ling1 Fu Daqi2 Zhu Yi2 Tian Huiqin2 Luo Yunbo2 Zhu Benzhong2（1Department of Food Science，Tianjin Agricultural University，Tianjin 30

4、0384；2Food Biotechnology Lab，College of Food Science &Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083）Abstract: Briefly，tomato tissues were fixed with different concentrations formaldehyde for 10 min（protein to DNA cross-linking），sonicated to shear the DNA into 200-1 000 bp

5、fragments，and then immunoprecipitated with anti-RIN antibody. After that，DNA fragments were extracted，purified，and ultimately detected by the general PCR assay and sequencing experiments. The optimal formaldehyde concentration to achieve efficient and reversible cross-linking turned out to be 1%. Af

6、ter testing various sonication conditions，we used 3 rounds of 6 seconds each at 20% power，which was sufficient to obtain 200-1 000 bp DNA fragments. The results showed that RIN transcription factor bound to the CArG box sequences of LeACS2 and LeACS4.Key words: Chromatin immunoprecipitation RIN tran

7、scription factor LeACS2 gene LeACS4 gene Tomato fruit真核生物基因表达是一个十分复杂而有序的过程，它是众多反式因子和顺式作用元件相互作用的结果。研究蛋白质与DNA 在染色质环境下的相互作用是阐明真核基因表达机制的基本途径。MADS box 转录因子家族具有重要的作用，其DNA 结合域有很高的亲和力，能与高度保守的CArG box基元结合1。RIN蛋白是MADS box 转录因子家族成员之一，在系统乙烯和系统乙烯的过渡阶段有极显著的作用2,3，而且会导致LeACS4基因表达量增加2。2002年，Vrebalov等4指出番茄ripening -i

8、nhibitor（rin ）携带编码MADS box转录因子的突变基因，不能将乙烯信号传递给下游的成熟相关基因，导致果实不能成熟。此后，确定转录因子RIN 的调控途径和其直接靶基因成为特别关注的研究领域。本实验室之前的研究已经证明，RIN融合蛋白有很好的DNA 结合活性5。Yokotani等6指出RIN 基因可能在LeACS2的转录后调控中发挥作用。Ito等7指出RIN 结合于顺式作用元件LeACS2。然而，年第期RIN 蛋白在番茄体内调控乙烯生物合成的机制仍不完全清楚。在细胞核中，有一种易被碱性染料染上颜色的物质，称为染色质，它是调节生物体新陈代谢、遗传和变异的物质基础。真核细胞的染色质由4

9、类分子组成：即DNA、RNA、组蛋白（富含赖氨酸和精氨酸的低分子量碱性蛋白）和非组蛋白。DNA和组蛋白的比例接近于11。染色质是一种动态结构，其形态随细胞周期不同而发生变化，进入有丝分裂时，染色质高度螺旋、折叠形成凝集的染色体。染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）技术是一种在体内研究DNA 和蛋白质相互作用的方法。与传统的研究转录因子和DNA 相互作用的方法相比，ChIP的优点在于能够在体内捕获转录因子和靶基因的相互作用，能在同时快速地提供一种或者多种基因的调控机制，所以有巨大的应用价值。近年来，此技术经过不断发展和完善，被广泛应用于体内转录

10、调控因子与特定染色质序列之间相互作用等方面的研究，并逐渐成为染色质水平基因表达调控研究的重要方法。由于能够灵敏地检测目的蛋白与特异DNA 片段的结合情况，因此可以用来研究组蛋白修饰在基因表达中的作用，是全面阐明真核基因表达调控机制的强有力的工具。特别是ChIP 技术与DNA 芯片和分子克隆技术相结合，可用于高通量筛选已知蛋白因子的未知DNA 靶位点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况。该技术在国外已经得到广泛应用，但在国内还鲜有报道，特别是在使用该技术确定转录因子RIN 的调控靶基因方面尚属空白。本研究利用ChIP 技术确定了转录因子RIN 的直接靶基因，以期揭示RIN 蛋白调控乙烯生物

11、合成的机制。1 材料与方法1.1 材料番茄品种为Lycopersicon esculentum Mill. cv. AilsaCraig，由美国番茄种质资源中心（Tomato Genetics Resource Center）馈赠。番茄在统一的栽培条件下种植，常规管理，均在花期挂牌，采摘花后46-48 d的粉红期番茄果实进行ChIP 试验。采摘、运输过程中避免机械伤害，挑选大小均匀，成熟度相对一致，无病虫害、无机械伤的一批果实作为试验材料。1.2 方法1.2.1 染色质免疫共沉淀技术 参照Upstate 公司Chromatin Immunoprecipitation Kit说明书，略有修改。首

12、先用甲醛在体内固定蛋白质和结合的DNA。取新鲜、健康的粉红期番茄果实组织，切成小块，并用双蒸水漂洗两次；将果实组织浸没于不同甲醛浓度的PBS 缓冲液中，真空渗透10 min，直到组织呈半透明状；加入终浓度为0.125 mol/L 的甘氨酸，再渗透5 min 以停止交联。弃去缓冲液，用预冷的双蒸水漂洗果实组织两次，且用液氮速冻。将果实组织放入预冷的研钵中，加入液氮，用研杵迅速研磨成粉末。粉末用预冷的PBS 缓冲液（含蛋白酶抑制剂）重悬。4，2 500 r/min 离心2-5 min，去掉上清。用1 mL SDS裂解缓冲液（含5 L 蛋白酶抑制剂）重悬。除非特别说明，以下所有步骤均按照说明书在4下

13、进行。通过超声波处理，将DNA 剪切成200-1 000 bp大小的片段，离心。上清液用ChIP 稀释缓冲液稀释，并用蛋白G 琼脂糖清洁，以降低非特异性背景。样品用相应的抗体进行免疫沉淀反应，于4摇动过夜。复合物用蛋白G 琼脂糖悬浮液收集；然后用试剂盒提供的低盐、高盐、LiCl洗脱缓冲液洗一次，再用TE 缓冲液洗两次。免疫沉淀的染色质用新配制的洗脱缓冲液洗去蛋白G。蛋白质和DNA 的交联复合物经过处理解交联，并用蛋白酶K 消化，以从DNA 中除去蛋白质。之后用试剂盒提供的纯化柱纯化DNA。取适量纯化后的DNA 样品（ChIP和Input）作为模板，进行PCR 检测。PCR反应完毕后，用2%琼脂

14、糖凝胶电泳观察结果。最后将PCR 产物进行测序，进一步验证ChIP 的试验结果。1.2.2 PCR 产物序列测定及分析 对DNA 样品的普通PCR 产物进行测序，序列测定工作由上海生工生物技术公司完成，用DNAMAN（版本4.0）软件分析测序结果。2 结果2.1 染色质免疫共沉淀技术甲醛浓度的确定番茄果实组织用不同浓度的甲醛溶液进行真空渗透，直到果肉组织呈现半透明状。因为只有未与蛋白质交联的DNA 能被提取出来，所以用苯酚提李玲等：利用染色质免疫共沉淀技术确定转录因子RIN 调控的靶基因生物技术通报 Biotechnology Bulletin2011年第12期168取的方法来评价DNA 和蛋

15、白质的交联效率。用含有不同甲醛浓度的缓冲液真空渗透新鲜番茄果实组织后，用酚仿提取解交联之前和解交联之后的DNA，结果（图1）显示，甲醛浓度为0%和0.5%时，不能使DNA 与蛋白质充分交联；甲醛浓度为3%和5%时，DNA和蛋白质的复合物不能充分解交联；能达到交联效率且保证解交联的最佳甲醛浓度是1%。的片段大小也没有达到后续试验的要求。而用20%功率，工作6 s，间隔10 s，脉冲3次，能够得到200-1 000 bp大小的DNA 片段，可以用于后续的试验。2.3 转录因子RIN 体内靶基因的分析 2.3.1 免疫沉淀的DNA 样品的普通PCR 检测 以粉红期番茄果实为材料，用1%甲醛在体内交联

16、DNA 和蛋白质。DNA和蛋白质的复合物用RIN 蛋白的特异性抗体和IgG 抗体（阴性对照）沉淀，沉淀的DNA 样品用特定的引物进行PCR 扩增，且以LeActin 作为对照。应注意，一定要在相应基因启动子区域的CArG box 基元附近设计引物，引物序列如表1所示。基因名称引物名称引物序列（5' -3' ）LeACS2CPACS2F AATTCTTTACGCAATCTTACTAAAT CPACS2R ACCCTTACATCATTTATTATTACAA LeACS4CPACS4F TCACAATTCAATAGTTACAGTTCAT CPACS4R TCAACAAGTACATGG

17、ACTATGAGTG LeACO1CPACO1F GGTCCTAACAGAGTTCGATGGGTTG CPACO1R TTAGGACACTTTGACTGGGATGT LeActinCPActinF CTTGACTATGAACAGGAACTCGAGA CPActinRGCAGTAATTTCTTTGCTCATTCTAT表1 普通PCR验证使用的引物序列M. DL15000 Marker; -. 解交联之前的DNA; +.解交联之后的DNA图1 染色质免疫共沉淀技术的交联效率分析2.2 染色质免疫共沉淀技术超声波条件的确定在番茄体内用甲醛固定DNA 和蛋白质复合物之后，需要用超声波的手段将其随机切断

18、为一定长度范围内的染色质小片段（200-1 000 bp），结果如图2所示。按图2-A 的超声波条件，将样品超声波之后，得到的片段大于2 000 bp，没有达到要求。按图2-C的超声波条件，将样品超声波之后，得到 A,B,C. 样品在10%、20%、25%功率条件下超声之后的结果, 均为工作6 s，间隔10 s，脉冲3次;1. 未超声的样品；2. 超声之后的样品；M.DL2000 Marker图2 染色质免疫共沉淀技术的超声处理效率分析图3结果显示，当用IgG 抗体沉淀DNA 和蛋白质的复合物时，均未扩增出LeACS2、LeACS4、LeACO1和LeActin 基因的PCR 产物。当用RIN

19、蛋A 顺式作用元件LeACS4的ChIP PCR分析；B 顺式作用元件LeACS2的ChIP PCR分析；C 顺式作用元件LeACO1的ChIP PCR分析；M.DL2000 Marker ；1.Input ；2.Blank ；3.IgG ；4.ChIP图3 R IN 蛋白与乙烯生物合成相关基因启动子片段的体内结合能力分析年第期白的特异性抗体沉淀DNA 和蛋白质的复合物时，在ChIP 样品中扩增出了LeACS2和LeACS4条带（图3-A、B，泳道4）。对照试验表明，LeActin序列没有在免疫沉淀复合物中扩增出来，但是在Input 样品中与LeACS2和LeACS4基因序列一样，是存在的。结

20、果说明LeACS2和LeACS4基因的启动子序列通过免疫共沉淀得到了富集，RIN蛋白在体内与LeACS2和LeACS4启动子区域上的CArG box结合。2.3.2 免疫沉淀的DNA 样品的普通PCR 产物测序分析 将图3中免疫沉淀的DNA 样品的普通PCR 产物进行测序。利用生物软件DNAMAN 将测序结果与已发表的LeACS2（X59139）和LeACS4（M88487）启动子序列进行比对。结果（图4）所示，PCR产物的序列与LeACS2和LeACS4启动子部分序列完全一致，进一步证实RIN 转录因子在体内与LeACS2和LeACS4启动子片段结合。 A.LeACS2 基因ChIP PCR

21、产物与LeACS2基因（X59139）启动子区域核苷酸序列比对；B.LeACS4基因ChIP PCR产物与LeACS4基因（M88487）启动子区域核苷酸序列比对图4 ChIP PCR产物测序结果序列比对3 讨论传统研究蛋白质与DNA 相互作用的方法是凝胶阻滞试验（EMSA）。高等生物的基因组DNA 与DNA 上的结合蛋白共同组成染色质结构，用EMSA 得到的某段DNA 与蛋白质相互作用的结果，在体内则很可能由于染色质高级结构的存在而使DNA 与蛋白质难以接近。因此，在生理状态下，这段DNA 很可能并不与其相对应的因子结合，是没有功能的。另外，染色质结构本身是动态的，DNA与非组蛋白在生理状态

22、下的相互作用通常是瞬时的，EMSA难以捕捉到发生在染色质上的基因表达调控的瞬时事件。所以，EMSA不足以充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用的真实情况。而染色质免疫共沉淀技术则可以找出在生理条件下某个DNA 结合蛋白与DNA 序列的结合位点，能够真实反映体内基因表达调控的情况8。本研究采用染色质免疫共沉淀技术在体内检测RIN 蛋白与乙烯生物合成相关基因启动子的结合能力。植物细胞和动物细胞的结构不同，植物细胞有严格的细胞壁，高水平的纤维素和木质素、大液泡，这致使不能将动物细胞的ChIP 技术直接应用于植物细胞。因此，需要对番茄果实组织的染色质免疫共沉淀试验条件进行优化。首先要使用真空渗透的方

23、法，以确保DNA 和蛋白质交联溶液渗入植物细胞。李玲等：利用染色质免疫共沉淀技术确定转录因子RIN 调控的靶基因生物技术通报 Biotechnology Bulletin2011年第12期170正如Das 等9所强调的，甲醛交联使DNA 与蛋白质形成复合物的步骤是非常重要的。结果显示，最佳的甲醛浓度是1%。当甲醛浓度更高时反而不起作用，这可能是因为高浓度的甲醛不能很好地解交联或者抑制了叶绿体的降解，导致与叶绿体连在一起的细胞核中的染色质难以纯化10。最佳超声波条件是20%功率，工作6 s，间隔10 s，脉冲3次。可以根据ChIP 技术的使用目的，选择不同的平均片段大小。例如，大片段（1 000

24、-2 000 bp）推荐用于克隆，小片段建议用于高分辨率的组蛋白修饰图谱研究11。染色质免疫共沉淀试验结果证实RIN 蛋白在体内与LeACS2和LeACS4启动子区域上的CArG box结合。RIN 融合蛋白没有体内结合LeACO1启动子的能力，原因之一可能是转录因子LeHB -1在番茄果实体内结合LeACO1启动子片段12。总之，以上结果说明RIN 蛋白在番茄果实乙烯生物合成过程中有重要作用，LeACS2和LeACS4是转录因子RIN 直接结合的靶基因。这个结果为阐明转录因子RIN 的作用机理奠定了理论基础。4 结论适用于番茄果实的最佳染色质免疫共沉淀试验条件为用1%甲醛溶液交联DNA 和蛋

25、白质的复合物用20%功率，工作6 s，间隔10 s，脉冲3次超声破碎该复合物，能够得到适当大小的片段。转录因子RIN 与LeACS2和LeACS4启动子区域的CArG box 序列结合，且在番茄果实的成熟过程中发挥重要作用。参 考 文 献1 T ang W，Perry SE. Binding site selection for the plant MADSdomain protein AGL15. An in vitro and in vivo study. J Biol Chem，2003，278（30）:28154-28159.2 B arry CS，Llop-Tous MI，Grier

26、son D. The regulation of1-aminocyclopropane -1-carboxylic acid synthase gene expressionduring the transition from system-1 to system-2 ethylene synthesis in tomato. Plant Physiol，2000，123（3）:979-986.3 C ara B，Giovannoni JJ. Molecular biology of ethylene duringtomato fruit development and maturation.

27、 Plant Sci，2008，175（1-2）:106-113.4 V rebalov J，Ruezinsky D，Padmanabhan V，et al. A MADS-boxgene necessary for fruit ripening at the tomato ripening-inhibitor （rin）locus. Science，2002，296（5566）:343-346.5 Z hu HL，Zhu BZ，Li YC，et al. Expression and DNA bindingactivity of the tomato transcription factor RIN（Ripening inhibitor）. Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，2008，72（1）:250-252. 6 Y okotani N，Nakano R，Imanishi S，et al. Ripening-associatedethylene biosynthesis in tomato fruit is autocatalytically and developmentally regulated. J