细胞生物学实验——上课用

1、一、目的要求1.了解普通光学显微镜的构造和原理。2.掌握普通光学显微镜的正确使用和维护方法。二、实验原理成像原理：显微镜是根据透镜成像的原理，对微小物体进行放大的。样品置于聚光镜与物镜之间，目镜、物镜、聚光器各自相当于一个凸透镜。平行的光线自反射镜折射入聚光器，光线经聚光器集聚增强，照射在标本上。样品的像经物镜放大成像，但像是倒像。目镜将此倒像进一步放大成像于人眼的视网膜上正像。三、实验用品普通光学显微镜、擦镜纸、香柏油、二甲苯、标本片等。四、内容与方法普通光学显微镜由机械部分和光学部分和照明部分等三部分组成（图1-1）1.机械部分：（1）镜座（Base）：在显微镜的底部，呈马蹄形、长方形、三

2、角形等。（2）镜臂（Arm）：连结镜座和镜筒之间的部分，呈圆弧形，作为移动显微镜时的握持部分。（3）镜筒（Tube）：位于镜臂上端的空心圆筒，是光线的通道。镜筒的上端可插入接目镜，下面与转换器相连。镜筒的长度一般为160mm。显微镜分为直筒式或斜筒式；有单筒式的，也有双筒式的。（4）转换器（Nosepiece）：位于镜筒下端，是一个可以旋转的圆盘。有34个孔，用于安装不同放大倍数的接物镜。（5）载物台（Stage）：是支持被检标本的平台，呈圆形或方形。中央有孔可透过光线，台上有用来固定标本的夹子和标本移动器。（6）调焦旋钮：包括粗调焦旋钮（Coarse adjustment knob）和细调焦

3、旋钮（Fine adjustment knob），是调节镜筒或载物台上下移动的装置。2.光学部分：由物镜、目镜、聚光器等部分组成。显微镜的重要性能参数是分辨率的大小（即镜头能判别物质两点间最小的距离D）。D越小，表示分辨率越高。D=普通光学显微镜能分辨率直径为0.2µm以上的物体。大部分细菌直径在0.5µm以上，故用油镜就能看清其个体形态。（2）目镜起放大镜的作用，经物镜放大的实像作进一部放大。低倍物镜下的视野深度与面积比高倍镜下大。故常用低倍镜寻找载玻片上的目标。观察的物体的工作距离与光圈大小之间的关系。（1）反光镜：载物台下方，镜柱前面的一个圆镜。一面为平面，一面为凹面

4、。平面镜聚光力弱，适于强光源和平行光源。凹面镜聚光力强，适用于弱光源和散射光源。反射镜的方位可以随意调节。（2）聚光器由聚光镜和可变光阑组成。聚光器边框上的数字代表其最大的数值孔径，其作用是把光线聚集在标本上，增强照明度。可变光阑是用以调节光强和聚光器数值孔径大小的，使物镜和聚光器的数值孔镜相符合。如果光圈开得太大，超过物镜的数值孔径，就会产生光斑；如果光圈开得太小，则分辨率下降，反差增大，都会降低物像的清晰度。五、显微镜的使用指南1.移动显微镜时要一手握持镜臂，一手托着镜座。2.使用时，应通过调整凳子高度，以便能舒适地观察，勿将显微镜倾斜。3.在观察标本时，应两眼同时睁开，这样既能同时绘图，

5、又能减少疲劳。4.调焦应细心，应采取将物镜调离标本的办法。5.用低倍镜时，光圈要适当缩小，以获得较好的对比度。随着放大倍数的增大，所需要光的量也要加大。6.镜检时，应首先用低倍镜进行调焦，再换高倍镜，最后用油浸镜进行观察。7.保持载物台清洁、无油。除油浸外，其它物镜不得接触香柏油。8.所有透镜应保持清洁，只能用擦镜纸擦拭镜头，不得用手触摸透镜。9.结束后，取下标本片，将油浸镜上的浸油擦拭干净，盖上防尘罩，放回箱内。10.显微镜发生故障，应立即向指导教师汇报，未经同意，不得随便更换显微镜。六、思考题1.使用显微镜应注意哪些事项？2.提高显微镜分辨率的方法有哪些？3.镜检标本时，为什么要先用低倍物

6、镜观察？实验二 细胞凝集反应一、实验目的1.学习植物凝集素的提取方法。2.观察红细胞凝集现象。二、实验原理细胞外被是指细胞质膜外表面的一层粘多糖物质，它在细胞间的联系和识别、细胞的生长和分化、免疫反应和肿瘤发生等过程中发挥重要作用。动物细胞表面的糖蛋白、糖脂中的糖链伸向膜的表面，它们是细胞识别、细胞免疫及细胞接触抑制现象的必要组分。凝集素是一类含糖的（少数例外）并能与糖专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果。凝集素与糖分子结合有一定的专一性和结合性，并与细胞膜上受体的分布有关。3、 实验用品 自己归纳总结四

7、、实验方法1.提取凝集素：称取土豆去皮块茎20g，加100ml PBS缓冲液，浸泡2h后，将浸出的粗提液过滤，即为含有可溶性的土豆凝集素。2.用滴管吸取土豆凝集素和2的红细胞悬液各1滴，置于双凹片上，充分混匀，静置10min后于低倍显微镜下观察血球凝集现象。3.以PBS液加2的红细胞悬液作对照实验。五、作业记录红细胞凝集情况。六、注意事项实验三 细胞膜的渗透性一、实验目的1.掌握细胞膜对不同物质的渗透性的一般规律。2.了解溶血现象及其发生机制。二、实验原理细胞膜是细胞与环境之间进行物质与能量交换的一种选择性通透屏障。它是一种半透膜，可选择性地控制不同物质进出细胞。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分

8、子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。三、实验用品自己总结四、实验步骤取7支试管，分别加入0.15mol/L NaCl溶液，0.005mol/L NaCl溶液，0.8mol/L 甲醇溶液，0.8mol/L 丙三醇溶液，氯仿，2TritonX-100各3ml，作出标记后，各管均加入50%鸡红细胞悬液2滴，混匀后静置于温室中，观察各支试

9、管中发生溶血的时间及其变化。在第7支试管中，加入蒸馏水后作对照。五、实验观察与溶血：试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下层红色不透明，镜检红细胞完好呈双凹盘状。：液体混浊，上层变红色，镜检有部分红细胞呈碎片。：液体变红而透明，镜检细胞全部呈碎片。六、统计不同浓度溶液的溶血情况，并进行分析。七、思考题红细胞在不同溶液中的溶血时间为什么不同？八、注意事项实验四 考马斯亮蓝染色显示植物细胞骨架一、实验目的1.掌握细胞骨架的光镜标本片的制作方法。2.了解细胞骨架的基本形态。二、实验原理细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网络体系，按组成成分和形态结构的不同分为微管、微丝和中间丝。它们对细胞形态的维持、细胞

10、的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。光镜下细胞骨架的形态学观察多用1 TritonX-100，可将细胞的大部分可溶性蛋白质及全部脂质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白质却被保存，再用考马斯亮蓝R250染色，使细胞质中细胞骨架得以清晰显现。三、实验用品（自己总结）（一）材料（二）器材（三）试剂四、实验方法1.取材用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮若干（约cm2），浸入装有PBS液的小烧杯中使其下沉，处理10min。2.抽提除去PBS液，加2ml 1 TritonX-100于小烧杯中，置于30恒温水浴锅处理30min。3.冲洗吸去1 TritonX-100，用M缓冲液轻轻洗3次，每次5min。4.固定

11、加3戊二醛固定20min。5.冲洗吸去固定液后，用PBS洗涤3次，每次5min。6.染色吸去PBS，滴5滴0.2考马斯亮蓝R250染液染色10min。7.制片倒去染液，用蒸馏水洗23次，将标本平铺在载玻片上，加盖玻片。五、作业描绘观察到的细胞骨架图像。六、思考题TritonX-100的缓冲液处理材料？2.列举你所知道的动植物细胞中由微丝、微管和中等纤维组成的结构。七、注意事项（）称取咪唑、KCl、MgCl2·H2、EGTA乙二醇双（氨基乙基）醚四乙酸380.35mg、EDTA、巯基乙醇0.07ml、甘油292ml，加蒸馏水至1000ml（用1mol/L HCl调pH为7.2），室温保

12、存。2.1 TritonX-100取TritonX-100 1ml，加M缓冲液99ml。3.3戊二醛25戊二醛3ml，PBS液97ml。考马斯亮蓝R250染液考马斯亮蓝R250，加入46.5ml甲醇、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5 ml。5.PBS（pH 7.2）A液：NaH2PO4·2H2O）936mg/LB液：Na2HPO4·12H2O）148mg/L工作液：A液68.5ml+B液31.5ml（用NaHCO3调pH）.实验五 动物细胞融合 1、 实验目的1. 掌握PEG诱导体外细胞融合的原理。2. 掌握细胞融合的方法。2、 原理两个或两个以上的细胞合并成一个双核或多核细胞

13、的现象称为细胞融合，也称细胞杂交。       诱导细胞融合的主要方法有：     1. 病毒诱导：常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。      2. 化学融合剂诱导：常用的是聚乙二醇（PEG）。PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：可促使细胞凝

14、结；破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核融合细胞。       3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。       细胞融合技术在基因定位、基因表达产物、肿瘤诊断核治疗、生物新品种培育及单克隆抗体技术等领域有着非常广泛的应用前景。单克隆抗体技术就是通过细胞融合技术发展起来的，在生命科学研究核应用方面产生了重大影响。三、实验用品自己总结四、实

15、验步骤1.用灭菌的注射器吸入2ml 3.8%的柠檬酸钠，从用75酒精消过毒的兔耳缘静脉处采取静脉血转入事先装有3.8%的柠檬酸钠的烧杯中使血液与柠檬酸钠的体积比为1：9，放入4冰箱中保存。2.取兔红细胞悬液lml移入l0ml的刻度离心管内，加入4ml 0.85生理盐水混匀，1500r/min离心5min；3.重复上述条件离心洗涤2次；4.收集最后一次离心沉淀的红细胞，用手指轻弹底壁使沉淀松散，加入4倍体积的GKN液，配成20的红细胞悬液。L加入1000L预热的50%PEG混匀，44水浴10min，再加入Hanks或Ringer液5ml终止PEG作用，再取红细胞悬液，滴于载玻片上，加0.2%次甲

16、基蓝1滴，盖上盖玻片观察。五、作业绘出观察到的细胞融合。六、注意事项实验六 线粒体和液泡系的超活染色与观察一、实验目的1.观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的形态数量与分布；2.学习细胞的超活染色技术。二、实验原理活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何理化变化以致引起细胞死亡。活体染色可分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定于细胞内某些特殊结构内以达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，是由活的动植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择

17、固定在活细胞的某种结构中而显色。活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料都可作为活体染色剂使用，一般应选择那些无毒或毒性小的碱性染料并配成较稀的溶液来使用。詹纳斯绿和中性红两种碱性染料是活体染色中重要的染料，对线粒体和液泡系的染色各有专一性。詹纳斯绿可专一性地对对线粒体进行活染，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被

18、还原为无色的色基。中性红对液泡系的染色具有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核和细胞质不着色，这可能与液泡中的某些蛋白质有关。三、实验用品1.器材；2.试剂；3.材料四、实验方法（一）线粒体的超活染色与观察（1）取清洁载玻片放在37恒温水浴锅的金属板上，滴2滴 1/5000詹纳斯绿溶液。（2）刮取口腔内壁的上皮细胞，放入染液滴中染色1015min，盖上盖玻片，吸去溢出的染液，观察。（1）滴一滴1/5000詹纳斯绿溶液于载玻片上，用镊子撕取一小片内表皮，置于染液中染色1015min。（2）用吸管吸去染液，加1滴Ringer溶液，注意展平，盖上盖玻片，观察。（二）液泡系的超活染色与观察绿豆

19、幼苗根尖（1cm长）小心切一纵切面，放入载玻片内的1/3000中性红染液滴中，染色510min。2.吸去染液，滴一滴Ringer溶液，盖上盖玻片，用镊子轻压盖玻片，使根尖压扁观察。五、作业1.绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布。洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体形态与分布。形态与分布。六、注意事项实验七Feulgen氏反应显示DNA一、实验目的1.学习DNA的Feulgen染色方法。2.了解Feulgen反应原理。二、实验原理DNA经弱酸（1mol/L HCl）水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基（CHO），这些醛基在原位与Schiff试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，形

20、成紫红色产物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用三氯乙酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应，从而证明了Feulgen反应的专一性。三、实验用品自己总结四、实验步骤1.水解：取一小段固定的洋葱根尖放入小烧杯中，加数滴1mol/L HCl置于60水浴箱中水解8min。对照材料在5三氯乙酸中90保温510min，随后再用1mol/L HCl置于60水浴箱中水解8min。2.漂洗：弃HCl后用蒸馏水漂洗片刻。3.染色：Schiff液染色30min。4.水洗：用新配制的亚硫酸水溶液洗3次，每

21、次5min，至出现红色。自来水冲洗5min。5.压片：滴一滴4.5的醋酸于载玻片上，将根尖放于载玻片上的醋酸中，加盖玻片轻压。七、作业观察记录实验结果，并绘图。八、思考题在进行Feulgen反应时为何用HCl水解？九、注意事项用具与药品（一）器材光学显微镜，剪刀，镊子，解剖针，解剖盘，染色缸，注射器，载玻片，盖玻片，擦镜纸，吸水纸，恒温水浴锅，10ml小烧杯（二）试剂1.Carnoy固定液：3份95酒精加入1份冰醋酸。2.1mol/L HCl盐酸：取浓盐酸8.25ml，加水至100ml。先将200ml蒸馏水煮沸，由火上取下，加入碱性品红1g，充分搅拌溶解。待溶液冷却到50时，过滤到磨口棕色试剂

22、瓶中。加入1mol/L HCl 20ml，冷却到25时加入1g偏重亚硫酸钾（K2S2O5）或偏重亚硫酸钠（Na2S2O5），充分振荡后盖紧瓶塞，放于暗处过夜。次日取出，呈淡黄色或近于无色，加中性活性炭0.5g，剧烈振荡1min，过滤后即得无色品红。保存时，需塞紧瓶塞，外包黑布或黑纸，贮存在4冰箱中（可保存数月或更长时间）。如液体变红则不宜再使用。10的Na2S2O5 5ml，1mol/L HCl 5ml，加蒸馏水至100ml，摇匀，塞紧瓶塞。此溶液现用现配，否则会因SO2的逸出而失效。5.5三氯乙酸称取5g三氯乙酸，蒸馏水定容至100ml。醋酸4.5ml醋酸用蒸馏水定容至100ml。实验八 酸

23、性磷酸酶的显示方法一、实验目的1.熟悉金属盐沉淀法显示酸性磷酸酶的原理及操作步骤。2.观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。二、实验原理酸性磷酸酶（acid phosphatase,ACP）主要存在于巨噬细胞，定位于溶酶体内。在溶酶体膜完整时，底物不易渗入，ACP活力微弱或无。经固定，在一定的pH条件下，膜的稳定性改变，其渗透性加大，底物可以渗入细胞内，酶的活力便可以显示出来。显示酸性磷酸酶的方法包括金属盐沉淀法和偶联偶氮法，本实验为金属盐沉淀法。其原理是：在酸性条件下（pH4.8），酸性磷酸酶可使作用液中的底物甘油磷酸钠的磷酸根解离出来，与溶液中硝酸铅结合形成磷酸铅，该沉淀物无色，需要再与黄色的硫化

24、胺作用显示，生成棕黑色硫化铅沉淀，进而显示该酶的活性。其主要反应过程如下：ACP甘油磷酸钠 甘油PO43PO43Pb(NO3)2 Pb3(PO4)2Pb3(PO4)2(NH4)2S PbS（棕黑）三、实验用品 自己总结四、实验方法与步骤1.实验前46d每天用无菌注射器取已灭菌的3淀粉溶液1ml注射于小鼠腹腔。5天注射34h后，颈椎脱臼处死小鼠，剖开腹腔，吸取腹腔液，在4预冷的载玻片上涂片。3.放入37ACP作用液中30min。2min。5.10甲醛钙固定液固定5min。2min。7.放入2硫化胺溶液35min。观察。对照实验：对照组的作用液中不加甘油磷酸钠，而以蒸馏水代替。或放入作用液之前先在

25、50水浴中处理30min，使酶失去活性，作好标记，然后同时进行上述过程。五、作业描述实验所得的结果，并进行分析。六、注意事项实验九 联会复合体的染色与观察一、实验目的学习光学显微镜显示联会复合体技术，观察其形态结构。二、实验原理联会复合体（synaptonemal complex,简称S.C）是减数分裂前期同源染色体配对形成的非永久性核内特殊结构，典型的S.C由三股平行的线状结构组成，即两条平行侧线和一条纤细的中央轴组成。一般开始于偶线期，成熟于粗线期，消失于双线期。它与减数分裂三个重要环节同源染色体联会、交换以及分离有着密切关系。2、 实验用品 自己总结四、实验方法1.颈椎脱臼处死雄性小鼠，取出睾丸，放入盛有2ml 0.7柠檬酸钠培养皿中。2.剪开白膜，用解剖针和