三氧化二砷对阿霉素耐药的白血病细胞血管新生相关因子的影响

1、三氧化二砷对阿霉素耐药的白血病细胞血管新生相关因子的影响         08-06-10 11:36:00     编辑：studa20                 作者：陈牧 张建东 张育 王晓铃 沈维干 李国青【摘要】  目的探讨三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3)对白血病耐

2、药细胞株K562/A02细胞血管新生相关因子血管内皮生长因子（VEGF）表达水平及基质金属蛋白酶2、9（MMP2、9）活性的影响。 方法用噻唑蓝法(MTT)测定As2O3对K562/A02细胞的增殖抑制作用，用酶联免疫吸附试验测定细胞上清中VEGF含量，用明胶酶谱法半定量测定细胞上清中MMP2、9的活性。 结果K562/A02细胞的IC50是（1.64±0.16）M，0.05M As2O3对细胞增殖和VEGF的表达没有明显影响，对MMP2、9的活性在24、48h无明显影响(P>0.05)，但在72h则对MMP2、9的活性有明显抑制作用(P<0.05)；0.4和3.2M A

3、s2O3可显著抑制细胞增殖，下调VEGF并使MMP2、9活性减弱(P<0.05)。结论As2O3可能通过下调VEGF的表达和抑制MMP2、9活性而发挥抗白血病细胞血管新生作用。 【关键词】  三氧化二砷； 血管内皮生长因子； 基质金属蛋白酶； 明胶酶谱Effect of Arsenic Trioxide on Related  Factors of Angiogenesis in K562/A02 CellsAbstract：Objective To investigate the effect of arsenic trioxide (As2O3) on the e

4、xpression of VEGF and the activity of MMP2 and 9 in K562/A02 cells. MethodsMTT assay was used to detect the inhibition ratio of K562/A02 cell. Enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the level of VEGF. Gelatin zymography assay was used to assess the activity of MMP2, 9. ResultsNe

5、ither the proliferation nor VEGF expression of K562/A02 cells was influenced by 0.05M  As2O3 after 24, 48 and 72 hours incubation. The activities   of   MMP2, 9 were not effected after 24, 48 hours incubation with 0.05M As2O3 (P>0.05),  but they were significantly in

6、hibited after 72 hours (P<0.05). 0.4 and 3.2M  As2O3 highly inhibited the proliferation, down regulated VEGF expression and inhibited the activity of MMP2, 9 of K562/A02 cells (P<0.05). ConclusionThe possible mechanism of antileukemic angiogenesis by As2O3 may be achieved by inhibiting th

7、e expression of VEGF and the activity of MMP2 and 9.Key words：Arsenic trioxide;VEGF; MMP;Gelatin zymography assay0引言肿瘤细胞的多药耐药(Multidrug resistance,  MDR)是导致临床白血病患者化疗失败的常见原因。 造成肿瘤细胞MDR的因素众多， 其中血管新生(Angiogenesis)与肿瘤多药耐药的关系正逐渐受到越来越多的重视。 肿瘤血管新生不仅是白血病发生、 发展和浸润的重要条件， 而且其相关因子， 如血管内皮生长因子(Vascular endot

8、helial growth factor， VEGF)和基质金属蛋白酶(Matrix  metalloproteinase， MMP)所具有的复杂的生物学效应也直接或间接增强了肿瘤细胞的MDR1, 2。 因此， 如果能有效下调多药耐药细胞表达的血管新生相关因子， 无论从肿瘤的血管新生还是多药耐药均具有积极意义。 本文即以白血病多药耐药细胞株K562/A02细胞为研究对象， 通过对不同浓度三氧化二砷（Arsenic trioxide，  As2O3）处理K562/A02细胞24、 48和72h后VEGF表达水平及MMP2、 9活性变化情况的研究， 进一步阐明了As2O3对多药

9、耐药细胞株K562/A02的VEGF和MMP2、 9的调控作用。1材料和方法1.1药物配制As2O3用1mM的NaOH溶液溶解并配成12.8mM贮备液，4贮存。实验前用培养基稀释成0、0.05、0.4和3.2M  4个浓度。1.2细胞培养K562/A02白血病耐药细胞株购自中国医学科学院天津血液学研究所，接种于RPMI1640培养基(含10%小牛血清，100/l青霉素, 100g/l链霉素)，用浓度为2g/ml的阿霉素以维持细胞耐药性，于37、5%  CO2、饱和湿度环境下常规培养。实验时提前两周停用阿霉素。1.3MTT法测定As2O3对K562/A02增殖抑制作用取对数生

10、长期细胞， 以 1×105/ml的浓度接种于96孔板， 培养24h后离心去上清， 加入不同浓度As2O3含药培养基， 孵育72h后用MTT法检测570nm处吸光度， 并计算细胞增殖抑制率。 抑制率=(1-加药组OD值/对照组OD值)×100%。1.4ELISA测定细胞上清中VEGF含量细胞接种于24孔板， 培养方法同上， 经不同浓度As2O3含药培养基孵育24、48和72h后收获细胞及上清。 VEGF检测过程按试剂盒(博士德生物工程有限公司)说明书操作， 在450nm处测定OD值并绘制标准曲线。 每组设3个复孔， 实验重复3次。1.5MMP2、9活性用明胶酶谱法检测实验方法

11、：取对数生长期细胞，用培养基调整为2×105/ml，接种于24孔板，培养24h后离心去上清，加入不同浓度As2O3孵育24、48、72h后收获上清。用Lowrys法测定细胞上清蛋白浓度，并将上样蛋白量调整为70g/18l，与1/6体积的上样缓冲液混合孵育30min，上样于含0.8%明胶的8%聚丙烯酰胺凝胶中进行垂直电泳，初始电压80V，待溴酚蓝至分离胶后加至150V。电泳结束后，将凝胶依次置于洗脱液中(25g/L   TritonX100，50mM TrisHCl，5mM CaCl2，1M  ZnCl2，pH  8.0)中振荡洗脱45min&#

12、215;3次；漂洗液中(不含TritonX100的洗脱液)振荡漂洗20min×3次，孵育液中(0.1M甘氨酸，50mM  TrisHCl，5mM  CaCl2，1mol/L  ZnCl2，0.5M  NaCl，pH  8.0)37恒温低速振荡孵育48h。用考马斯亮蓝染液(0.1%考马斯亮蓝R250，甲醇300ml，冰醋酸100ml，蒸馏水450ml)染色1.5h，脱色液(30%甲醇，10%醋酸)脱色至阳性条带清晰且背景对比度适宜时取出凝胶，经成像后即可对其进行半定量分析。结果评价：电泳后负染带亮度的强弱和面积大小可以半定量地表征明胶酶

13、的活性大小。金属蛋白酶活性评分方案在孙晓敏等3的评分法基础上有所改进，即：“0”分，条带勉强可辨或未见任何条带；“1”分，条带边缘及中央模糊，但可辨认，宽度小于1mm；“2”分，条带边缘锐利且中央清晰，宽度小于1mm；“3”分，条带边缘模糊但中央清晰，宽度12mm；“4”分，条带边缘锐利且中央清晰，宽度12mm。1.6数据统计方法    IC50及ELISA实验数据用±s表示。组间数据比较采用t检验和one way ANOVA,  P<0.05认为有统计学意义，用SPSS10.0软件进行统计学分析。2结果2.1As2O3对K562/A02细胞的增殖抑制作用As2O3孵育K562/A02细胞72h后，MTT法测得IC50是(1.64±0.16)M。0.05M As2O3对K562/A02细胞的抑制率为0.64%，可轻微促进细胞增殖，但无统计学意义(P>0.05)；0.4和3.2M As2O3则对K562/A02细胞增殖的抑制率分别为25.1%和64.4%，表现为明显的抑制作用(P<0.05)。2.2As2O3对K562/A02表达VEGF的抑制作用ELISA法检测VEGF的标准曲线回归率为99.8%。结果显示：0.05M