乳过氧化物酶系统与变链菌葡糖基转移酶D之间的相互作用

1、    乳过氧化物酶系统与变链菌葡糖基转移酶D之间的相互作用        摘要目的：本研究检测了过氧化物酶系统(乳过氧化物酶LP, 过氧化氢H2O2, 硫氰酸盐SCN-)及其各组份对变链菌葡糖基转移酶D（GtfD）的作用。方法：变链菌GtfD由重组菌提纯, GtfD与含葡聚糖和蔗糖（含C14标记葡萄糖）的氯化钾缓冲液孵育，经闪烁计数器测定GtfD活性；过氧化物酶系统及其组份对GtfD活性的影响，通过将这些组份单独或共同和GtfD孵育得以测定。结果和结论：过氧化物酶系统抗微生

2、物因子低硫氰酸/低硫氰酸盐离子( HOSCN/OSCN)对变形链球菌葡糖基转移酶D没有抑制作用，而乳过氧化物酶本身则抑制GtfD活性。然而，如果LP与其底物共同作用，则增加GtfD活性。关键词葡糖基转移酶；变形链球菌；过氧化物酶；龋病中分类号R781.1文献标识码A文章编号1000-4661(2000)02-0087-03The effects of the lactoperoxidase system on the activity of glucosyltransferase D originating from S. mutansYU Xiao-xia（School of stomato

3、logy, Haerbin Medical University, Harbin 150001）Abstract Objective: To investigate the effects of the lactoperoxidase system (LP, H2O2 , SCN-) and its components on the activity of glucosyltransferase D (GtfD) originating from S. mutans. Methods: GtfD of S. mutans was purified from recombinant bacte

4、ria. GtfD was incubated in buffered-KCl solution with dextran and sucrose containing sucrose- 14C-glucose. The bound activity of GtfD was measured with a scintillation counter. The effects of peroxidase system and its components on the activity of GtfD were examined by incubating different component

5、s separately and together with GtfD. Results and Conclusions: Lactoperoxidase system-generated antimicrobial hypothiocyanite acid/ions ( HOSCN/OSCN) had no effect on the activity of streptococcal GtfD while the lactoperoxidase enzyme as such inhibited GtfD. However, if LP was combined with its subst

6、rates, it enhanced the activity of GtfD. Key words glucosyltransferase；S mutans；peroxidase；caries变形链球葡萄糖基转移酶（Gtf）催化蔗糖形成细胞外葡聚糖，这是牙菌斑和龋病发生的一个重要因素1。变链菌分泌三种葡糖基转移酶葡糖基转移酶B、C、D（GtfB、Gtf C、Gtf D）。GtfB主要催化水不溶性葡聚糖合成，GtfD催化水溶性葡聚糖合成，而GtfC催化水溶性和水不溶性两种多聚物的形成2。唾液过氧化物酶系统在维持口腔健康方面有诸多作用3。唾液过氧化物酶系统由过氧化物酶、过氧化氢(H2O2)和硫氰

7、酸盐(SCN-)组成，其活性成分是酶促反应生成物低硫氰酸盐离子（OSCN-）或低硫氰酸（HOSCN）。乳过氧化物酶(LP)的催化活性和结构性能与唾液过氧化物酶极为接近4，因此，有关过氧化物酶功能方面的研究，一直广泛应用LP。获得性膜通过许多机制影响菌斑形成和龋病发生发展。膜分子作为结合位点选择性地吸附口腔微生物，而且，唾液源性的酶（如溶菌酶、唾液过氧化物酶、淀粉酶）和菌源性酶（如葡糖基转移酶）已证实在实验膜状态下是具有酶活性的5，6，7，然而，对菌源性酶和宿主源性酶之间可能存在的相互作用所知甚少。本研究旨在研究过氧化物酶系统及其各组份对变形链球菌葡糖基转移酶D的作用。材料和方法变链菌Gtf由重

8、组菌提纯2，其活性测定如Germaine等人8（1974）所述方法，后经Loimaranta等（1997）9改良。简言之，5g GtfD与含20M葡聚糖10 000和100M蔗糖（含C14标记葡萄糖）氯化钾缓冲液孵育，37，4h，然后加入冷甲醇终止反应，冰浴过夜,将所形成的葡聚糖沉淀，MaB滤膜（法国产）过滤，甲醇冲洗三次，经闪烁计数器（Wallc，芬兰）测定GtfD活性。过氧化物酶系统及其组份对GtfD活性的影响，通过将这些组份单独或共同和GtfD孵育得以测定。首先，测定OSCN-对GtfD的作用，加入5g乳过氧化物酶（LP，sigma，美国），1.0mM硫氰酸钾和各种不同浓度的过氧化氢，G

9、tfD活性测定如上所述。LP活性通过测定OSCN-的生成加以证实。其次，测定过氧化物酶系统不同组份（如LP、KSCN、H2O2）对GtfD活性的作用，孵育GtfD和各种不同浓度的这些物质达到此目的。结果检测混合物中LP具有活性，能有效地形成OSCN-（表1）。过氧化物酶系统在pH 6.5，pH 5.5时均明显增强了GtfD活性，然而，这种增强作用并不依赖于OSCN-浓度（1）。附表混合物中低硫氰酸盐(m)的生成量PH0510501002006.5041246801405.50574385167检测混合物中含有5g LP，1.0mM KSCN和不同浓度的H2O2(0200m)，PH6.5，PH5

10、.5。 1过氧化物酶产物OSCN- (见表1) 对 GtfD 活性作用（pH 6.5， pH5.5）。 GtfD的反应混合物中加入5g LP, 1.0 mM KSCN 和不同浓度的H2O2 (0-200 M)，GtfD 活性测定如文中所述。数值代表：均值±标准差 (n=3)。LP单独作用明显抑制GtfD活性，加入0.01-1.0mM SCN-阻断了这种抑制作用，并且，加入高浓度H2O2（200M）则抑制作用消失，而低浓度H2O2（5M）没有此作用（2）。此外，如果增加或减少LP的量，LP抑制GtfD的作用则消失。提示，两种酶（LP和GtfD）之间的比例起着重要作用（3）。2过氧化物酶

11、及其底物对GtfD 活性作用 （pH 6.5）。GtfD与5g LP孵育, 或与5M, 200M H2O2 孵育，或与 0.01 mM, 1.0 mM KSCN孵育, GtfD 活性测定如文中所述。数值代表：均值±标准差 (n=3)。3过氧化物酶对GtfD 活性作用（ pH 6.5）。GtfD的反应混合物中加入不同重量的LP (0-10g)，GtfD 活性测定如文中所述。数值代表：均值±标准差 (n=3)。讨论本研究结果提示，过氧化物酶系统生成的低硫氰酸盐对变形链球菌GtfD没有作用，而乳过氧化物酶本身则抑制GtfD活性。但是，如果LP与其底物硫氰酸盐和/或高浓度H2O2结

12、合，则GtfD活性增加。许多获得性膜和菌斑中的唾液大分子在液相条件下能增强葡糖基转移酶的活性。这些大分子包括宿主源的，如分泌型IgA、磷酸蛋白质、血型反应性物质、磷脂以及细菌源的，如核糖核酸等5，10，11。随着变形链球菌葡糖基转移酶基因的分离及表达，可获得更纯、更满意、更可信赖的Gtf酶，这些手段有助于更精确地研究、鉴定菌源性酶和唾液各组份的相互作用。Venkitaraman等2（1995）报道，液相Gtf酶与吸附于羟磷灰石表面的Gtf酶性能不同，并指出，GtfD所形成的水溶性葡聚糖作用之一是作为GtfB形成水不溶性葡聚糖的前体2。本实验表明，LP单独与GtfD（重量比1:1）孵育时抑制Gt

13、fD活性，而如果改变LP的量，则LP介导的抑制作用消失。其抑制机制尚不清楚，可能是LP以某种形式与GtfD相结合，抑制了GtfD活性。有学者提出，酶附着于固体表面，其构象可能发生改变，导致酶活性位点发生变化。在我们检测中，当LP与GtfD相结合时，就可能发生了GtfD活性位点的构象变化。LP若与底物共同作用于GtfD，则增加了GtfD活性，可能是LP更易与其底物特异性结合，发生相应的构象变化，阻断了与GtfD结合的有效位点，从而阻断了LP对GtfD的抑制作用, 甚至增加GtfD活性。过氧化物酶系统所有组份都是唾液中的正常成分12，13，14。口腔中SCN-很快被过氧化物酶利用产生抗微生物因子H

14、OSCN和OSCN-，该因子与口腔细菌相互作用。因此， 唾液SCN-对口腔过氧化物系统而言更加重要，对LP-SCN-联合作用于GtfD而言则不显重要。本文结论为，过氧化物酶产生的抗微生物因子HOSCN/OSCN-并不抑制GtfD活性，而LP酶本身在低浓度时就抑制了GtfD活性。我们认为，这是由于LP与GtfD以某种方式结合，抑制了与龋病相关的变链菌分泌的GtfD，这是否仍发生于获得性膜结合的酶尚在研究之中。本研究由芬兰科学院、芬兰牙科学协会和中国留学基金委资助。作者简介于晓霞(1963)，女，黑龙江哈尔滨市人，硕士，副主任医师，1998年赴芬兰尔库大学牙科研究所龋病部，美国纽约罗切斯特大学龋病

15、研究中心齿科研究部研修，研究方向：唾液抗微生物因子。于晓霞（哈尔滨医科大学口腔医学院，黑龙江哈尔滨150001）参考文献1Colby SM, McLaughlin RE, Ferretti JJ, et al. Effect of inactivation of gtf genes on adherence of streptococcus downei. Oral Microbiol Immunol, 1999; 14: 27-322Venkitaraman AR, Vacca-Smith AM, Kopec LK, et al. Characterization of Glucosyltr

16、ansferaseB, GtfC, and GtfD in solution and on the surface of hydroxyapatite. J Dent Res, 1995; 74: 1695-17013Tenovuo J. Nonimmunoglobulin defense factors in human saliva. In: Tenovuo J, ed. Human Saliva: Clinical chemistry and Microbiology. Vol II, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, USA, 1989; 56-

17、914Mansson-Rahemtulla B, Rahemtulla F, Humphreys-Beher MG. Human salivary peroxidase and bovine lactoperoxidase are cross-reactive. J Dent Res 1990; 66: 1839-18465Schilling KM and Bowen WH. The activity of glucosyltransferase adsorbed onto saliva-coated hydroxyapatite. J Dent Res 1988;67:2-86Vacca-S

18、mith AM and Bowen WH. The effect of milk and kappa casein on Streptococcal glucosyltransferase. Caries Res 1995; 29: 498-5067Tenovuo J. The peroxidase system in human secretions. In: Pruitt KM and Tenovuo J, eds. The Lactoperoxidase System, Chemistry and Biological Significance. Marcel Dekki Inc., N

19、ew York, USA. 1985; 101-1228Germaine GR, Schachtele CF and Chludzinski AM. Rapid filter paper assay for the dextransucrase activity from streptococcus mutans. J Dent Res 1974;53: 1355-13609Loimaranta V, Tenovuo J, Virtanen S, et al. Generation of bovine immune colostrum against strepotococcus mutans

20、 and streptococcus sobrinus and its effect on glucose uptake and extracellular polysaccharide formation by mutan streptococci. Vaccine, 1997; 15:1261-126810Rolla G, Ciardi JE and Schultz SA. Adsorption of glucosyltransferase to saliva coated hydroxyapatite- possible mechanism for sucrose dependent bacterial colonization of teeth. S