不同粒径磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对肝癌细胞生物学特性的影响

1、不同粒径磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对肝癌细胞生物学特性的影响         11-03-24 10:11:00     编辑：studa20                  作者：居会祥, 戴真煜, 孙明忠, 吕晶晶 【摘要】  目的： 研究不同粒径磁性纳米FeOx在外加磁场作用

2、下对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。方法： 采用共沉淀法制备得到不同粒径FeOx，将不同粒径FeOx吸附于细胞表面，并加载静磁场(SMF)及100 Hz交变磁场(EMF)照射。运用CCK8检测纳米粒子吸附后在外加磁场作用下Bel7402细胞增殖情况，运用流式细胞仪检测细胞凋亡、死亡率及细胞周期变化。结果： 不同粒径磁性纳米FeOx在SMF照射时间低于72 h时能使Bel7402细胞增殖速度增快，当照射时间大于72 h时，细胞增殖速度未发生明显变化但部分细胞发生凋亡，凋亡率为(3.1±0.78)。而经EMF照射后37 nm FeOx吸附细胞增殖被抑制，细胞周期实验结果表明大部分细胞被阻滞在G

3、0/G1期，细胞出现大量死亡与凋亡，凋亡率达到(23.34±3.6)、死亡率达到(57.24±2.7)。结论： 纳米粒子未有外加磁场照射时不能对细胞产生明显的影响，外加SMF照射时，细胞的增殖及DNA代谢未发生明显的变化，但细胞发生凋亡；外加EMF照射时，细胞增殖被抑制并发生明显的凋亡及死亡，细胞DNA代谢明显紊乱，且具有较小粒径的磁性纳米FeOx在EMF作用下对肝癌细胞影响最为显著。 【关键词】  磁性纳米FeOx； 增殖； 凋亡； DNA周期AbstractObjective: To study the effects of different diamete

4、rs of nano FeOx powders on proliferation and DNA metabolism of heptomacell lines Bel7402.Methods： Different diameters of nano FeOx powders were utilized to dope the heptomacell lines Bel7402 through the coprecipitation meanings, then cells were exposed by static magnetic field(SMF) and extremely low

5、 frequency altering magnetic field(EMF) with 100 Hz. After exposed by external fields, CCK8 kit was used to detect the effects on proliferation of cells caused by nano powders. Apoptosis kit and DNA cycle kit was used to detect the effects caused by nano FeOx of cell apoptosis, death and cell DNA cy

6、cle metabolism. Results： Different diameters nano FeOx could not influence the cell at all under SMF exposure but could influence the cells under EMF, when the diameter was 37 nm the highest apoptosis and death ration were (23.34±3.6) and (57.24±2.7)%, respectively, and the most of cells w

7、ere prohibited in G0/G1 period of DNA cycle.  Conclusion： nano powders could not influence the cells at all without external magnetic field exposure. Under SMF exposure the proliferation and DNA metabolism of cells absorbing by nano powders were not influenced, but the apoptosis ratio of cells

8、was increased. After exposure by EMF cells absorbing by nano powders could be affected in proliferation, apoptosis and DNA metabolism，furthermore, all the effects were more obvious in the cells absorbing by nano powders with little diameter under EMF exposure.Key wordsmagnetic nano FeOx； proliferati

9、on； apoptosis； DNA cycle   磁性纳米材料具有良好的磁导向性、较好的生物相容性、生物降解性和活性能基团等特点1-3，它可结合各种功能分子，如酶、抗体、细胞、DNA或RNA等，因而在靶向药物、控制释放、酶的固定化、免疫测定、DNA和细胞的分离与分类等领域可望有广泛的应用。磁性纳米材料特别是Fe属纳米颗粒已经被广泛应用于药物靶向治疗及干细胞定向移植治疗中4。当粒径在30200 nm之间时，矫顽力和饱和磁化强度均达到最大值，且具有单畴特性。目前已有纳米磁性氧化铁等颗粒作为药物或干细胞载体用于肝癌动物实验的研究，但对磁性纳米氧化铁粒子本体对人体研究

10、相对较少5。本研究以肝癌细胞Bel7402为对象，观察不同粒径磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对其生物学特性的影响，旨在为FeOx用于治疗肝癌提供实验依据。    1  材料和方法    1.1  试剂及仪器    肝癌细胞株Bel7402购自中国科学院上海细胞库。静磁场发生仪为两块强磁场稀有金属镍/铁永磁体，当两块磁体间距为2.5 cm时其场强为0.7特斯拉（T）。TYU2002H II型特斯拉计/高斯计为上海亨通磁电科技有限公司产品。变频仪(FT1000型)为南京万臣电子有限公司产

11、品，变压器(PT800型)为上海富济电子公司产品。胰蛋白酶、Primilar1640培养基、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司，二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，维生素C、青霉素、链霉素为杭州四季青公司产品。CCK8试剂盒为美国ADL公司产品，细胞凋亡及周期试剂盒均购自美国BD公司。FeSO4、醋酸锌均为分析纯，购自南京化学试剂有限公司。扫描电镜(SEM)型号为HITACHIX650，X射线衍射仪(XRD)型号为Philips Xpert XRD system型。    1.2  方法1.2.1  磁性纳米FeOx的制备 

12、;运用共沉淀法5以FeSO4及醋酸锌为反应物，反应在乙醇、水（13）混合溶剂中进行并加入质量百分比为2的甘油，制备得到醋酸亚铁前驱体，前驱体粉末灼烧温度为400，灼烧4 h后得到FeOx粉体，10 000 r/min离心30 min，得到上下两层不同粒径粉末，经SEM及XRD实验确定其粒径及成分组成。SEM实验前样品用超声清洗仪超声分散10 min。XRD实验条件为：扫描速率为2/min，测定纳米粉体XRD谱。1.2.2  磁性纳米FeOx吸附细胞实验 将不同粒径纳米FeOx加入到细胞培养瓶中与细胞共同培养。纳米粒子吸附细胞方法为：将细胞消化成细胞悬液并调整细胞浓度大于10

13、5个/ml，再将不同粒径纳米粒子加入到细胞悬液中并在恒温摇床中匀速振荡30 min，摇床摇速为200 r/min。振荡完成后将细胞置于细胞培养箱中培养。细胞培养2 d后经SEM实验确定磁性纳米FeOx结合效率。1.2.3  细胞培养   细胞种植到含10FBS PIMIRIER 1640培养基的培养瓶，放置在37，5CO2培养箱持续培养。细胞传代时用胰蛋白酶消化细胞成细胞悬液，磷酸盐缓冲液（PBS）1 500 r/min 15 min离心洗涤2次，用含10FBS 1640培养基重悬细胞后种植细胞，每次细胞种植浓度应大于105个/ml。细胞临时保存在-70超低温冰箱

14、，永久保存在液氮罐中，细胞冻存液配比为DMEMFBSDMSO=721(体积比)，细胞冻存浓度应高于106个/ml。1.2.4  磁场照射细胞方法 静磁场(SMF)照射细胞方法为：将细胞培养瓶置于两块永磁体之中，同时置于细胞培养箱中培养，每间隔12 h照射1次，每次照射30 min，直至84 h。100 Hz交变磁场(EMF)照射细胞方法为：将细胞培养瓶置于离工作线圈顶端2 cm，经特斯拉计测量磁感应强度为0.67 mT，每间隔4 h照射1次，每次照射30 min，直至40 h。照射完成后，细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液进行各种检测。1.2.5  CCK8细胞增殖实验

15、 按试剂盒提供实验方法进行。首先取出96孔酶标板，依照次序对应分别加入50 l的标准品于酶标板微孔中，分别标记样品编号，将50 l细胞培养悬液（2.5×104个/ml）加入到酶标板中；在标准孔和样品孔中加入100 l的酶标记液，36孵育1 h，将溶液倾出， PBS清洗5次后每孔加入底物A，B液各50 l，36下避光孵育反应15 min后加入终止液50 l，终止反应。测定450 nm的光密度值。每隔12 h重复进行以上步骤，72 h得到细胞增殖数据绘制细胞增殖曲线。1.2.6  细胞凋亡、死亡及周期实验 细胞凋亡及周期实验均在流式细胞仪上完成，均按试剂盒提

16、供实验方法进行。凋亡实验方法为：将细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液，并用PBS洗涤2次并将细胞浓度重悬调整为106个/ml。染色过程为首先用微量移液枪移取20 l细胞悬液，然后用AnnexinV加入到细胞悬液中并避光静置15 min后将PI染料加入并静置30 min，染色完成后上机实验。细胞周期实验方法为：首先按凋亡实验相同方法处理细胞以待上机检测，染色方法为将试剂盒内A，B，C，D 4种试剂按顺序分别加入到细胞悬液中，避光静置时间均为15 min。染色完成后上机实验。流式细胞仪实验条件为：细胞进样流速中速，前向角补偿电势为56 V。1.2.7  统计分析 实验结果用±

17、;s表示，使用SPSS13.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析，以=0.05为检验水准。2  结果    2.1  纳米FeOx表征实验结果    SEM及XRD实验结果表明两种粒子的平均粒径分别为37，70 nm左右，粒子形状为不规则球形（图1，2）。根据Scherrer 公式：D=K/cos，其中D为粒子粒径，K为形状因子，为X 衍射的波长，为衍射峰的半峰宽，为衍射角。经XRD实验结果证明粒子中Fe，O两种元素的比例为11.12。图3为2种FeOx与Bel7402细胞吸附情况，图中FeOx为黑色颗粒，FeO

18、x与Bel7402细胞发生了较为明显的吸附，37 nm粒子更易于在细胞表面吸附，表现为每个细胞表面吸附粒子数量明显增加。    (a)37 nmFeOx(×30 000倍）(b)70 nmFeOx(×10 000倍)2.2  细胞增殖实验结果    不同粒径纳米FeOx在未经磁场照射时并未对细胞增殖产生明显的影响，细胞经SMF照射其增殖在磁场照射初期速度变快，当照射时间超过72 h后增殖未发生明显改变(相对对照组)。 经EMF照射后两种粒子吸附细胞的增殖均被抑制，当EMF照射时间为5 h时细胞增殖抑制率达

19、到最大，37nm FeOx抑制率达到（76.31±2.3），70 nm FeOx抑制率为（53.56±5.2）。2.3  细胞凋亡及死亡实验结果    从表1可见，凋亡率、死亡率3组间比较差异无统计学意义，说明未经磁场照射的纳米粒子不能导致细胞死亡及凋亡。表2可见37 nm和70 nm FeOx吸附细胞经SMF照射达到60 h后，细胞发生凋亡，当照射时间为72 h时37 nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（3.13±0.78），70 nm FeOx吸附细胞的凋亡率仅为（1.25±0.23）。而未经磁场照射37nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（0.01±0.03），70 nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（0.02±0.04），未经FeOx吸附细胞的凋亡率为（0.01±0.02）