影响链格孢菌生长及产孢的因子-

1、17(11619中国生物防治Ch inese Journal of B i ol ogical Control2001年2月影响链格孢菌生长及产孢的因子黄世文1,余柳青1,A lan K1W atson2(11中国水稻研究所,杭州310006;21Internati onal R ice Research Institute,P1O1Box933,M anila1099,Phili pp ines摘要:在实验室研究了影响稗草病原真菌链格孢生长及产孢的因子。链格孢菌可在较宽的温度范围内生长、繁殖;连续黑暗、空气充足条件下有利于产孢;该菌在4种不同的植物产品上培养可产生大量的孢子,最多的无芒稗籽上

2、每克干物质产孢量达3159×108个,这些培养物在首次产孢收获后均可直接培养作二次产孢利用。固体(菌块和液体(菌悬液接种培养物均能成功产孢。但培养量大时液体接种优于固体接种,产孢量与接种菌悬液浓度呈正相关。关键词:链格孢菌;生长;产孢;生物防治分类号:S45;Q949.331+.3文献标识码:A文章编号:100529261(20010120016204目前,一些稗草微生物制剂已处于试用阶段或已商品化13。国内近年在稗草病原菌的筛选、评价方面也有一些报道46。链格孢菌属(A lternaria s pp.是一类寄主范围很广的病原真菌,可寄生多种杂草和作物,至今有12种链格孢菌已开发或正

3、在开发成微生物除草剂,如决明链格孢(A.cassiae防治钝叶决明、望江南、美丽猪屎豆;百日草链格孢(A.z inniae防治苍耳;粗链格孢(A.crassa防治曼陀罗等79。一般认为,真菌微生物制剂多是利用其孢子,这是因为孢子不论是稳定性、活力、侵染力还是寿命等方面均比真菌其它阶段更具优势10。因此,开发廉价、高效、可大量生产菌孢子的培养基及其技术是真菌微生物制剂成功的关键。稗草链格孢菌A lternaria alternata(F r.Keissler是从田间自然罹病的稗草标样上分离获得,经生测,该菌对稗草致病力强,鲜重防效在60%左右,对水稻小苗有轻度影响,但随后可恢复正常。在从稗草病标

4、样中分离到的近百个病原菌中,该菌占41.3%,是感染稗草造成叶片和叶鞘病斑的主要病原真菌之一,本文研究了影响该菌生长及产孢的多种因子。1材料与方法1.1菌种的分离、培养和保存链格孢菌是作者从田间自然感病稗草标样中分离获得,经单孢纯化后在半强度PDA斜面培养基上于4保存备用。接种时移入PDA培养基平板中央,于28±0.5恒温培养7天,取边缘、生长旺盛的菌丝块作为接种体。1.2温度对菌生长及产孢的影响直径9c m(下同消毒培养皿中倒入20m l PDA培养基,接入7mm直径菌块,处理温度:收稿日期:2000204218基金项目:农业部“九五”高新技术重点项目(02-03-03;国际合作项

5、目作者简介:黄世文(19622,男,学士,副研究员。第1期黄世文等:影响链格孢菌生长及产孢的因子(128±0.5恒温;(29月份室温,昼 夜温度28 20左右;(312月份室温,昼 夜温度20 8左右;(4温室:温度13±133±1(室温、温室温度用最高最低寒暑表每天记录,下同,处理后2天以十字交叉法测量菌落直径,每隔1天测量1次,直到生长最快的处理长满培养皿,同时观察菌落颜色、形状。最后一次测量后,用含0.05%吐温220的无菌水20m l刮下菌落及孢子,装广口瓶中充分摇匀,用2层纱布过滤得菌悬液,用血球计数器在显微镜下测量孢子含量,并最终计算出每皿产孢数。各处

6、理重复3次,以下均相同。1.3光照、通气对产孢的影响培养皿中倒入20m l PDA培养基,接种菌块后,A组培养皿用parafil m胶带封口,B组不封口。处理(1置恒温28±0.5连续黑暗培养;(2用3层黑布包裹(模拟连续黑暗置9月份室温;(3不用布包裹置室温(自然光培养7、14天。按1.2法收集、计算每皿产孢数。1.4不同培养基质对产孢的影响称取大麦、小麦、无芒稗籽粒、米糠及晒干后的稗秆、稗叶(0.5c m长各10g置250m l三角瓶中,除米糠加5m l温开水(拌匀达饱和不滴水外,其他均加水10m l预浸24小时,121高温高压处理30分钟,取出冷却后接菌种2块,充分摇匀。置28

7、±0.5培养7、14天,用100m l 0105%吐温220无菌水洗下孢子,2层纱布过滤,收集孢子,按1.2法测量孢子数,计算每克干物质产孢量。过滤后培养物挤干水分均匀摊开,连纱布置培养皿中,恒温培养,作二次产孢试验。7天后以同样方法收集孢子,计算孢子数。1.5接种方法和接种浓度对产孢的影响设计链格孢菌不同接种方法和接种量在无芒稗籽上的产孢试验。(1菌块(固体接种;(2菌悬液(液体接种:2m l浓度为3.5×106个孢子 m l菌悬液,接于10g稗籽上,充分摇匀,作如下处理:置恒温28±0.5黑暗培养;置12月室温培养;置温室13±133±1培

8、养;(3不同浓度菌悬液接种:50g干稗籽装入500m l三角瓶中,加50m l温开水预浸24小时消毒后分别用5块1c m直径菌块和10m l菌悬液接种,菌悬液浓度分别为3.5×107、3.5×108、3.5×109个 m l,置恒温、温室和12月室温条件下培养,分别在7、14、21天按1.4法收获孢子,计算产孢量,进行统计分析。2结果与分析2.1温度对菌生长及产孢的影响链格孢菌菌落在28±0.5恒温下开始生长速度较快,前2天生长速度为7.5mm d,后为11mm d;在9月室温较高、昼夜温差不大的情况下,菌落生长较好,室温较低的12月和昼夜温差较大的温室

9、,菌落生长较慢(表1。生长较快的处理,菌丝丰富,孢子相对较少;相反,生长较慢的处理菌丝较少,相对地孢子产量较高。菌丝(孢子初为淡黄至黄褐色,随着培养时间延长,逐渐转为黑色。2.2光照、通气对产孢的影响链格孢菌在PDA培养基上,不同处理条件下产孢水平差异显著。连续黑暗条件下培养,不论是恒温还是室温自然条件,培养皿不用parafil m封口时产孢能力强,封口条件下菌株产孢能力明显降低;室温不封口连续黑暗培养产孢能力要强于室温不封口自然光照(表2。说明连续黑暗,空气充足条件下有利于该菌产孢。表1温度对链格孢菌生长及产孢的影响处理菌落直径(mm 2d4d 6d 8d 8d 产孢量(107个 皿恒温15

10、.0a 45.5a 64.0a 86.5a4.6c 温室11.5c 36.5b 56.5b 75.5ab 8.3a 室温12月13.0b 41.0ab 59.5b82.0a 3.9d 室温9月8.8d12.0c39.5c68.0b7.2b注:同列数据后不同字母表示5%水平下差异显著,下同。表2光照和通气对产孢的影响条件处理方法7d 14d恒温黑暗封口0.86d 3.37c黑暗不封口3.16b 16.04a 室温9月黑暗封口0.58e 3.04c 黑暗不封口6.64a 15.96a 自然光封口0.37f 2.78c 自然光不封口1.57c14.56b注:封口指用parafli m 胶带密封培养皿

11、。2.3不同培养基质对产孢的影响链格孢菌在无芒稗籽、稗茎、稗叶、大麦粒、小麦粒、米糠4种不同植物产品上都能大量产生孢子(表3,菌株在这些物质中培养7或14天收获孢子后,培养基质还可继续培养作二次产孢利用,其中在无芒稗籽上产孢量最多。培养7和14天每克干稗籽两次产孢之和分别可达3.59×108和3.16×108个孢子。产孢量较少的米糠每克干物质的两次产孢量之和也分别达到1.09×108和7.56×107个孢子,其产孢量与在PDA 培养基上培养7天的每皿产孢量相当。链格孢菌在稗秆和稗叶上均能大量产生孢子,两者产量相差不大,但产孢量明显少于稗籽。表3不同培养基

12、质对产孢的影响(107个孢子 g 干物质培养物7d一次产孢二次产孢14d一次产孢二次产孢培养物7d一次产孢二次产孢14d一次产孢二次产孢米糠0. 50f10.35b 1.18d6.38c无芒稗籽13.20a 22.72a 16.30a15.30a 麦粒3.93d 9.41c 6.90c 8.40b 稗秆6.52b 4.36e 8.61b 3.14e 大麦粒3.68e 8.80d8.95b 4.13d 稗叶5.86c4.02e6.29c2.78ePDA10.57-33.50-2.4接种方法和接种浓度对产孢的影响链格孢菌不论是采用固体还是液体接种,不论恒温、室温和温室条件下均可在无芒稗籽上大量产生

13、孢子。在培养物较少(10g 稗籽的情况下,固体接种产孢量多于液体接种。但随着培养量的增加(50g 稗籽、接种菌悬液浓度的提高,液体接种法每克无芒稗籽产孢量明显多于固体接种的产孢量(图。A :菌块接种;B :菌悬液接种(3.5×107 m l ;C :菌悬液接种(3.5×108 m l ;D :菌悬液接种(3.5×109 m l 图不同接种方法、浓度链格孢菌在无芒稗籽上的产孢比较3讨论链格孢菌适应性强,相对较低或较高的温度只能减缓而不会抑制其生长繁殖,昼夜变温更中国生物防治第17卷第1期黄世文等:影响链格孢菌生长及产孢的因子有利于孢子形成。链格孢菌生长繁殖快,对营养

14、要求低,产孢能力强,在一些廉价农产品上均可大量产生孢子。培养基质在第一次收获孢子后还可作二次产孢利用。其生长及产孢特性正是病原菌成为微生物制剂所必须的。连续黑暗、空气充足条件下有利于链格孢菌产孢。链格孢菌对稗草及其它杂草的致病性,寄主范围特别是对水稻及相近的禾本科作物的毒性还需作进一步的研究,该菌与其它杂草病原菌、化学除草剂混用对杂草的防效也值得探讨。参考文献1Tebeest O D,Yang X B,et al.The status of bi ol ogical control of w eeds w ith fungal pathogensJ.A nn.Rev.Phytopathol.,

15、1992,17:302310.2W ats on A K,et al.P rogress of a bi ol ogicalw eed control p roject in rice2based cropp ing syste m s in Southeast A siaR.The16th A sian2PacificW eed Science Society Conference.1997.342344.3Bow ers R C.Comm ercializati on of Collego,an industrialists vie wJ.W eed Sci.,1986,34:2425.4

16、王明旭,罗宽.稗叶枯菌及其毒素的研究: .病原鉴定及产孢产毒条件J.湖南农学院学报,1991,17(1:3441.5陈勇,倪汉文.中国稗草病原真菌对稗草及水稻的致病性J.中国生物防治,1999,15(2:7376.6Yu L iuqing,W ats on A K,H uang Shi w en,et al.Screening and Evaluati on of Barnyardgrass(E chinochloa s pp.PathogensDB.V ietna m:W orkshop of IP M N etwork,1999.7强胜.生物除草剂的研究概况J.杂草科学,1996,2:11

17、14.8李树正,岳东霞,刘准,等.茄链格孢培养滤液抗菌活性物质的研究J.植物病理学报,1997,27(2:161165.9董金皋,樊慕贞,杨英如,等.芸苔链格孢菌种内和链格孢菌种间的酯酶同工酶比较J.植物病理学报,1997,27(2:167173.10Boyette C D,Q ui m by P C J r,Connick W J,et al.P rogress in the p roducti o n,for m ulati o n and app licati o n of m ycoherbicidesA.In:Tebeest D O,ed.M icrobial Control ofW

18、 eedsM.N e w York:Chapm an and Hall,1992.209222.Factors Affecti n g Growth and Sporula ti on of A lterna ria a lterna taHUAN G Sh i w en,YU L iuqing,A lan K1W ats on(Ch ina N ati onal R ice R esearch In stitute,H angzhou310006,Ch inaAbstract:T he grow th and con idia p roducti on characteristics of A lternaria alternata (F r1Keissler,a pathogen ic fungus of barnyardgrass(E ch inochola s pp1w as studied in labo rato ry1A1alternata could grow and s po rulate bet w een13±1-33±11T he ability of con idia p roducti on w as p romo ted in con tinuous dark an