引物序列验证

1、引物序列验证引物设计完成之后，需要用软件进行分析，找到最佳的引物对，采用Blast分析验证引物，可以知道序列的正确性，也能知道引物的特异性状况、引物的具体位置以及PCR产物的大小。先找到需要设计引物的目标基因的在有引物序列的mRNA序列，可以通过全文（如最先发现该基因的文章），全文中有时可以找到大鼠c-jun mRNA序列的ACCESSION NUMBER，在PubMed中的“Nucleotide”中用此ACCESSION NUMBER就能找到序列。可以利用这个ACCESSION NUMBER在PubMed中的“Nucleotide”中搜索到序列后，点击右边的“Links”，再点击里面的“Re

2、lated Sequences”就能找到所有的大鼠c-jun mRNA序列及其他物种的一些c-jun mRNA序列。文献中的引物最好先验证其序列正确，并用软件分析引物比较好后再采用。通过BLAST验证，既可知道序列是否正确，也可同时了解引物的特异性、引物的位置及PCR产物的大小等。如果仅仅是为了验证引物序列是否正确（仅适合于基于完全匹配原则设计的引物），也可以用Blast的“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”搜索，具体方法为：1. 打开Blast，点击“Nucleotide

3、-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”2. 等新页面完全显示后，将引物序列直接copy到“Search”框（没有必要将下游引物序列转换成其互补链），下面3种方法都可以（我觉得这3种方法的搜索结果没有什么区别，没仔细比较过哦！）（）直接拷贝上游引物序列，然后直接将下游引物序列拷贝在上游引物后面（）直接拷贝上游引物序列，在上游引物序列后加一空格，然后直接将下游引物序列拷贝在空格后面（）直接拷贝上游引物序列，换行，然后直接拷贝下游引物序列注意：记住上、下游引物的长度，如上游引物为19bp、下游引物为18

4、bp，这在查看Blast结果时有用。3. 点击“BLAST！”，新页面完全出来以后，点击“Format！”。4. 结果完全出来后，查找有没有和1-19、20-37同时完全匹配的基因，其他的就不用考虑了。当然，如果下游引物序列所对应的基因片段的3'端正好和上游引物序列的3'端的1或2个碱基互补，那就可能是19-37或18-37。如果有，那你的引物序列就是正确的。从文献上查的引物，除了要用Blast验证其序列是否正确外，还是应该用软件分析分析到底引物好不好。实例1、进入网页：/BLAST/2、点击Search for short,

5、 nearly exact matches3、 在search栏中输入引物系列：注：文献报道ABCG2的引物为5-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3;5-TGCCCATCACAACATCATCT-3(1)输入方法可先输入上游引物，进行blast程序，同样方法在进行下游引物的blast程序。这种方法叫繁琐，而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下游引物匹配的系列之后看两者的交叉。(2)简便的做法是同时输入上下游引物：有以下两种方法。输入上下游引物系列都从53。A、输入上游引物 空格 输入下游引物B、输入上游引物 回车 输入下游引物4、 在options for a

6、dvanced blasting中：select from 栏通过菜单选择Homo sapiens【ORGN】Expect后面的数字改为105、在format中：select from 栏通过菜单选择Homo sapiens【ORGN】Expect后面的数字填上0 106、 点击网页中最下面的“BLAST!”7、 出现新的网页，点击Format!8、 等待若干秒之后，出现results of BLAST的网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。(1)图形格式：图中代表这些序列与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于4050分图中代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于4050分，而与

7、下游引物不互补图中代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分，而与上游引物不匹配通过点击相应的bar可以得到匹配情况的详细信息。(2)结果信息概要：从左到右分别为：A、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息B、系列的简单描述C、高比值片段对(high-scoring segment pairs, HSP)的字符得分。按照得分的高低由大到小排列。得分的计算公式=匹配的碱基×2+0.1。举例：如果有20个碱基匹配，则其得分为40.1。D、E值：代表被比对的两个序列不相关的可能性。【The E value decreases exponentially as the Score

8、 (S) that is assigned to a match between two sequences increases】。E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。设定的E值是我们限定的上限，E值太高的就不显示了E、最后一栏有的有UEG的字样，其中：U代表：Unigene数据库E代表：GEO profiles数据库G代表：Gene数据库(3)结果详细信息：圈出来的部分代表序列的信息第一个大括号代表上游引物与该序列的正链【Plus/Plus】的匹配情况：共有21个碱基匹配，得分42.1分【21×2+0.1=42.1】，E值为0.020上游引物与序列的21432163位点匹

9、配第二个大括号代表下游引物与该序列的负链【Plus/Minus】的匹配情况：共有20个碱基匹配，得分40.1分【20×2+0.1=40.1】，E值为0.077。下游引物与该序列的2936029379位点互补注意点：上游引物为20个碱基，为什么会变成21个碱基呢?这是因为下游引物的第一个碱基为T，刚好与系列的2163位点的T匹配，因此下游引物的开头的第一个碱基被当成了上游引物了。同理，上游引物的最后一个碱基为G，被当成了下游引物了。通过寻找有没有与120位点、2040位点完全匹配的序列，就可以避免这个因素的干扰了。为什么与上下游引物匹配的ABCG2序列有多种?A、 为同一个基因来源的不

10、同的mRNA片段B、 为该基因的DNA系列C、 为同一个基因来源的不同的cDNA克隆片段。结果判断：验证文献报道的引物是否正确：如果你可以在所显示的结果中找出你的目的基因，一般说明你的引物正确性没问题。如果你blast后没有发现你的目的基因，或者分值很低，该引物就可能不适合用检测该引物是否存有同源序列相匹配，造成PCR反应的非特异扩增。如果上游引物和下游引物都找到的相同的基因，并且分数非常高。这种结果表明所设计的引物序列特异性不高，最好重新设计引物，否则会得到非特异扩增的PCR产物。如何验证设计引物序列是否合适？zz合集 (2012-08-10 11:09:38)转载标签：杂谈1.检验引物的特

11、异性Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。Primer-BLAST可以直接从Blast主页（/）找到，或是直接用下面的链接进入：/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物

12、an important feature for PCR protocols measuring tissue specific expression（注：没办法准确的翻译，只好作罢，汗！）。Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。 Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）。跟其它的BLAST一样，点击底

13、部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。模板（Template）在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。 引物（Primers）如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。可以在Primer Parameters区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库（在specificity check区选择）。根据需要

14、可设置产物的大小，Tm值等。特异性（Specificity）在specificity check区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。这里提供了4种数据库：RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)。前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。特别是，当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。selected reference assemblies 包括以下的物种： human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 rice。Nr数据库覆盖NCBI所有的物种。2.验证引物自身的特性