实验一 质粒DNA的提取及检测

1、实验一实验一 质粒质粒DNA的提取及检测的提取及检测质粒质粒（plasmid）n是染色体外小型（是染色体外小型（1-2001-200kbkb）的共价、闭合、的共价、闭合、环状的双链环状的双链DNADNA分子（分子（cccDNAcccDNA），），能自主复制能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。并能稳定遗传的遗传因子。 n常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等酶、修饰酶等 n质粒的复制：严紧型复制（质粒的复制：严紧型复制（1 1 n n个个）松弛型复制（松弛型复制（2

2、020个以上）个以上） 常用的质粒载体常用的质粒载体n是通过是通过DNADNA重组技术构建而成的。重组技术构建而成的。pUC18, pUC19pUC18, pUC19质粒提取的思路质粒提取的思路n质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNADNAn要去除的物质：要去除的物质：n蛋白蛋白n基因组基因组DNADNAn脂类及小分子杂质脂类及小分子杂质nRNA RNA 第一部分质粒第一部分质粒DNA的提取的提取一目的一目的n了解提取质粒的原理。了解提取质粒的原理。n学习和掌握质粒提取的方法和技术。学习和掌握质粒提取的方法和技术。n细菌的生长和质粒的扩增细菌的生长和

3、质粒的扩增n菌体的收集裂解及质粒菌体的收集裂解及质粒DNA的分离的分离n质粒质粒DNA的纯化的纯化二原理二原理n碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：拓扑学上的差异：n在在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；仍为自然状态；n将将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之之间交联形成不溶性网状结构，大部分间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA

4、和蛋白质在去污和蛋白质在去污剂剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白及蛋白质，质粒质，质粒DNA尚在上清中，尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒粒DNA（可省略）（可省略）。原理示意图原理示意图 返回目录 返回原理三、实验仪器、材料与试剂三、实验仪器、材料与试剂 （一）仪器：恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅（一）仪器：恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含（二）材料：含pUC18pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌、

5、（或其他）质粒的大肠杆菌、（三）试剂：（三）试剂： LBLB培养基（液体、固体）培养基（液体、固体）溶液溶液I I溶液溶液IIII溶液溶液IIIIIITE(pH8.0)TE(pH8.0)溶液溶液 In50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖/1mg/mL溶菌酶溶菌酶n25 mmol/L TrisCl (pH8.0)n10 mmol/L EDTA (pH8.0)n在在10 lbf/in2(6.895104Pa)高压下蒸汽灭菌高压下蒸汽灭菌15分钟，分钟，保存于保存于4。 n作用：裂解细胞，鳌合金属离子使金属酶失活作用：裂解细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液溶液 IIn0.2 mol/ L NaOH(从从

6、5mol/L贮存液中现用稀释贮存液中现用稀释)n1% SDSn作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液溶液 IIIn5mol/L 乙酸钾乙酸钾60mln冰乙酸冰乙酸11.5mln水水28.5mln所配成的溶液中钾的浓度为所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为，乙酸根的浓度为5mol/L。n作用：酸性条件下质粒作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白复性，变性蛋白-SDS线线性性DNA沉淀，沉淀，K可中和可中和DNATE(pH8.0)n10 mmol/L TrisCl (pH8.0)1 mmol/L EDTA (pH8

7、.0)nRNA酶（降解酶（降解RNA）n作用：稳定作用：稳定特点：小量质粒制备、最简便、快捷特点：小量质粒制备、最简便、快捷应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提） 测序、转染（细提）测序、转染（细提）质粒提取试剂盒质粒提取试剂盒常用方法：小量碱裂解法常用方法：小量碱裂解法满足不同需要的试剂盒满足不同需要的试剂盒纯化原理：离子交换柱层析等纯化原理：离子交换柱层析等小量制备质粒小量制备质粒kit大量制备质粒大量制备质粒kit去除内毒素制备质粒去除内毒素制备质粒kit可用于大部分分生实验可用于大部分分生实验四、实验步骤四、实验步骤接含接含pUC18(pUC18(或或pET2

8、1a)pET21a)质粒的单菌落于质粒的单菌落于3 3ml LB Ampml LB Amp+ +液体培养基中液体培养基中37370 0C C，190rpm190rpm振荡培养过夜振荡培养过夜取取1.5 ml菌液入菌液入1.5ml的离心管中的离心管中 60006000rpmrpm、离心离心2 2minmin，弃上清，收集菌体弃上清，收集菌体100100uLuL溶液溶液I I悬浮菌体（悬浮菌体（充分振荡充分振荡），室温），室温1010minmin加入加入200200uLuL溶液溶液IIII（轻轻混匀轻轻混匀），冰上静置），冰上静置5 5minmin裂解菌体裂解菌体加入加入150150uLuL溶液溶

9、液IIIIII（轻轻混匀轻轻混匀），冰上静置），冰上静置1515minmin质粒质粒DNADNA复性复性1200012000rpmrpm，离心离心1515minmin，取上清取上清记录体积记录体积到一新管到一新管上清加等体积的酚：氯仿（上清加等体积的酚：氯仿（振荡混匀振荡混匀）1200012000rpmrpm，离心离心1515minmin，取上清记录体积到一新管取上清记录体积到一新管上清加上清加2 2倍体积的无水乙醇（倍体积的无水乙醇（充分混匀充分混匀），冰浴），冰浴 30min 30min1200012000rpmrpm，离心离心1515minmin沉淀用沉淀用75%75%乙醇乙醇1 1mL

10、mL洗涤两次（洗涤两次（轻弹混匀、离心轻弹混匀、离心）1200012000rpmrpm，离心离心1010minmin晾干沉淀晾干沉淀沉淀用沉淀用2020ul TEul TE溶解溶解沉淀法沉淀法吸附管用吸附管用BL 500ulBL 500ul平衡平衡取上清加入吸附管取上清加入吸附管5000rpm 5000rpm 离心离心5min5min加加PWPW漂洗液漂洗液500ul500ul，放置，放置2min2min10000rpm 10000rpm 离心离心5min5min，晾干，晾干加加3 30 0ul TEul TE，10000rpm 10000rpm 离心离心5min5min（收集到干净的（收集到

11、干净的EPEP管中）管中）吸附法吸附法第二部分琼脂糖凝胶电泳第二部分琼脂糖凝胶电泳相关知识相关知识n电泳：泳动速度决定于？电泳：泳动速度决定于？ n琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶天然琼脂（天然琼脂（AgarAgar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖是一种多聚糖，主要由琼脂糖（AgaroseAgarose ，约占约占8080）及琼脂胶（）及琼脂胶（AgaropectinAgaropectin）组组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场

12、作用下能产生多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。 琼脂糖凝胶浓度与线性琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围分辨范围 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 n不同构型不同构型DNADNA的移动速度依次为：共价闭环超的移动速度依次为：共价闭环超螺旋螺旋DNADNA（cccDNAcccDNA

13、）直线直线DNADNA（LDNALDNA，2 2条链条链发生断裂）开环的双链环状发生断裂）开环的双链环状DNADNA（ocDNAocDNA，1 1条链发生断裂）条链发生断裂）。 影响迁移率的因素影响迁移率的因素nDNADNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNADNA的构的构象、所加电压（一般象、所加电压（一般5 5V/cmV/cm）、电场方向、嵌电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等。入染料的存在、电泳缓冲液的组成等。一、实验目的一、实验目的n通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA的方法和技术。的方法和技术。二、实验原理

14、二、实验原理 nDNADNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。n核酸为两性分子，在核酸为两性分子，在pH3.5pH3.5时，整个分子带正电时，整个分子带正电, ,pH8pH8左右左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 n在碱性环境下，相同碱基数量的双链在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNADNA几乎具有等量的几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的相对分子质量的DNADNA片段泳动速度不一样，可进行分离。片段泳动速度

15、不一样，可进行分离。DNADNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。可以近似用于估算分子的大小。n可以分离相对分子质量相同，但构型不同的可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNADNA分子。分子。共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋DNADNA（cccDNAcccDNA）直线直线DNADNA（LDNALDNA，2 2条链条链发生断裂）开环的双链环状发生断裂）开环的双链环状DNADNA（ocDNAocDNA，1 1条链发生断条链发生断裂）。裂）。 质粒的电泳质粒的电泳质粒质粒DNA的的3种形式泳动速度种形式泳动速度

16、:超螺旋超螺旋线性线性开环开环 质粒质粒DNA的存在形式有的存在形式有3种种:1、共价闭环共价闭环DNA:常以超螺旋常以超螺旋形式存在形式存在 2、开环开环DNA:质粒质粒DNA两条链两条链中有一条发生一处或多处断裂，中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张因此可以自由旋转从而消除张力力,形成松弛的环状分子形成松弛的环状分子 3、线性线性DNA:因质粒因质粒DNA的两的两条链在同一处断裂而造成条链在同一处断裂而造成.开环开环超螺旋超螺旋线性线性三、仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂 n（一）仪器：稳流稳压电泳仪（一）仪器：稳流稳压电泳仪n（二）材料（二）材料1.1.自已提取的质粒自

17、已提取的质粒DNADNA2.2.相对分子质量标准品相对分子质量标准品（三）试剂（三）试剂 1 15 5TBETBE储液储液(pH8.0)(pH8.0)使用时稀释使用时稀释 10 10倍，成倍，成1 1TBETBE。 2 2凝胶加样缓冲液（凝胶加样缓冲液（loading buffer） 3. 3. 1% 1% 琼脂糖琼脂糖 4. 10 4. 10mg/mlmg/ml溴化乙锭溶液（溴化乙锭溶液（EBEB），），44保存。用时稀释成保存。用时稀释成 5 5ugug/ml/ml的的EBEB。 四操作步骤四操作步骤琼脂糖（琼脂糖（1%）凝胶电泳）凝胶电泳1.称取一定量琼脂糖凝胶，按称取一定量琼脂糖凝胶，

18、按1g中中100ml的量加入电泳缓冲的量加入电泳缓冲液，微波炉中加热约液，微波炉中加热约2min，使琼脂糖溶解；，使琼脂糖溶解；2.溶液冷至溶液冷至60 ，加入，加入 EB至终浓度为至终浓度为0.5g/ml，混匀，注，混匀，注意戴手套操作；意戴手套操作；3.将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为0.3-0.5cm，迅，迅速插上梳子，检查有无气泡；速插上梳子，检查有无气泡；4.待凝胶完全凝固后（约待凝胶完全凝固后（约30min），小心取出梳子，将凝胶），小心取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入电泳板置于电泳槽中，加入电泳buffer，让液面高出胶面，让液面高出胶面1mm；5.在在DNA样品（样品（20ul）中加入）中加入6 loading buffer（4ul），），混匀后用移液枪将样品加入样品孔中电泳，电压混匀后用移液枪将样品加入样品孔中电泳，电压100V ；6.根据指示剂的位置，判断是否终止电泳根据指示剂的位置，判断是否终止电泳;7.在紫外灯下凝胶成像仪上观察电泳结果。在紫外灯下凝胶成像仪上观察