一种新的吡咯多胺镍配合物的合成及其与DNA的作用研究

1、·研究论文·一种新的吡咯多胺镍配合物的合成及其与 DNA 的作用研究邹敏刘叔文周春琼*(南方医科大学药学院 广州 510515)摘要 合成了一种新的吡咯-多胺金属镍配合物, 并用质谱、核磁、红外、摩尔电导、元素分析等多种手段分析了配体和配合物的结构; 紫外、荧光和黏度等方法分析了镍配合物与小牛胸腺 DNA (CT DNA)的作用, 发现配合物以插入方 式与 DNA 结合; 电泳法研究发现配合物在反应温度为 5055 间可将超螺旋 pBR 322 DNA 完全切割为缺刻产物; 细 胞水平抗肿瘤实验表明该镍配合物具有一定的抗肝癌活性.关键词 吡咯; 多胺; 镍配合物; DNA;

2、 抗肝癌活性Synthesis and Studies on DNA-binding of a New Nickel Complex withPyrrole and PolyamineZhou, Chunqiong*Zou, MinLiu, Shuwen(School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, Guangzhou 510515)Abstract A new nickel complex of pyrrole-polyamine had been synthesized and its structure h

3、ad beencharacterized by MS, 1H NMR, IR, molar conductance and elementary analysis. CT DNA-binding of nickel complex had been investigated using UV spectra, fluorescent spectra and viscosity. The results have proved that the mode of binding of nickel complex to CT DNA is the intercalative mode. The c

4、omplex can com-pletely translate supercoil DNA into the nicked DNA between 50 and 55 . The complex has antitumor ac-tivity on HepG2, a liver tumor derived cell line.Keywords pyrrole; polyamine; nickel complex; DNA; antitumor activity得到重视, 有研究发现吡咯-多胺铜配合物4具有很好的 DNA 切割活性. 本文合成了一种新的多胺-吡咯镍配 合物, 研究了配合物与 D

5、NA 的作用, 初步研究了镍配合物的抗肝癌活性, 这对后期工作中设计更有效的人工 核酸酶及其抗肿瘤药物提供了重要的研究基础和参考价值.多胺化学核酸酶对新型肿瘤、抗艾滋病化学药物的定向设计及其基因治疗等方面均有重要意义和应用前 景, 其原因在于多胺类化合物能与多种分子配位, 不仅 能在体外与 DNA 特异性结合, 而且还能穿透细胞膜、 穿过核膜, 进入细胞核内抑制基因表达. 如杜俊等发现 的单取代大环多胺铜-铂异核配合物具有较好的 DNA 切割活性1; 多胺类 Zn(II)配合物在 H2O2 存在下也能水 解断裂 DNA2; 二水杨醛三乙基四胺镁配合物可将超 螺旋 DNA 水解为线性产物3. 为

6、提高多胺化合物对 DNA 的特异选择性, 将 DNA 识别体系吡咯、咪唑、吡 咯-咪唑等聚酰胺化合物与多胺类化合物结合, 合成特 异性识别 DNA 能力更高的人工核酸切割试剂的研究正1实验部分1.1 试剂与仪器小牛胸腺 DNA, 购自华美生物工程公司; 溴化乙 锭(EB)购自舒伯韦公司; Hep G2 肝癌细胞株由南方医科* E-mail: huagongzhoucq163 Received September 4, 2009; revised November 9, 2009; accepted November 26, 2009.广东省自然科学基金(No. 7300452)资助项目.482

7、化 学 学 报Vol. 68, 20101.2.2镍配合物的合成和表征将上述配体(0.3044 g, 0.667 mmol)溶于 25 mL DMF 溶液中, 将 NiSO46H2O (0.178 g, 0.667 mmol)溶于 10 mL 水中, 再将其在搅拌下加入配体溶液中, 室温搅 20 h, 减压蒸馏除去溶剂, 将残渣用甲醇溶出, 滤液置于冰 箱中冷却得到蓝绿色固体, 过滤、水洗、干燥, 得到产 品 NiL. IR (KBr) : 3435.94 (OH), 3336.29 (OH),大学药学院抗病毒研究中心保存; 其他试剂均为国产分析纯试剂. PE-240C 元素分析仪; ZQ40

8、00 液相色谱-质谱 联用仪; Shimadzu FTIR-8300 红外光谱仪, KBr 压片;Bruker Am-300 MHz 核磁共振仪; DDS-11A 电导率仪; TU-1901 双光束紫外可见分光光度计; RF-5301PC 荧光光谱仪 ; 乌 氏黏度计 ( 毛细管内 径 0.5 0.6 mm); BECKMAN 34 pH 计; Tanon EPS300 电泳仪; Tanon HE-90 电泳槽; Alpha Hp 3400 荧光/可见数字图像分析仪; GENios Pro TECAN 多功能酶标仪.1.2 配体和镍配合物的合成及表征通过元素分析、质谱、核磁、红外、熔点测定、摩

9、 尔电导等多种手段表征, 配体和配合物结构式4见图 1.3268.10 (NH),1614.19 (CO),3124.79 (NH),1527.55 (CC),2957.21 (CH),1498.47 (CC), (CNO2, CN),1420.54 (NCH3, CN), 1311.181137.39 (CH2NH, CN), 1102.69 (CH2NH, CN),846.28 (CNO2, CN), 779.02 (NH), 750.28 (NH).FAB-MS: 639.1 (MH). Anal. calcd for C H N -18 30 8O12SNi: C 33.71, N 1

10、7.47, H 4.71; found C 33.65, N17.70, H 4.52. 比较配体与配合物的红外光谱图: 配合 物在 3435.94 和 3336.29 cm1 处出现了两个羟基峰, 根据质谱和元素分析结果表明配合物中存在水分子, 再结 合电导率仪分析结果表明两个水分子中的氧与 Ni 发生 配位, 形成 NiO 键; 配体中位于 3276.46 和 3137.79cm1 处有两个不同位点的氨基的伸缩振动峰, 当形成 配合物之后均向低频迁移至 3268.10 和 3124.70 cm1, 这表明金属离子与氨基上的氮原子发生了配位; 配体中位于 1655.48 cm1 处的 CO

11、的伸缩振动峰在配合物中 向低频迁移至 1614.19 cm1 处, 说明金属离子与 CO 上的氧原子配位形成 NiO 键. 配制 1 mmol/L 的镍配合物的水溶液, 其摩尔电导率为 205 Scm2mol1; 相同图 1 配体及镍配合物的结构式Figure 1 Structure of ligand and nickel complex1.2.1 配体的合成和表征参考文献4方法合成了配体 N1,N8-二(1-甲基-4-硝 基吡咯-2-酰基)三乙基四胺. m.p. 174176 , 与文 献4基本吻合. 1H NMR (DMSO, 300 MHz), : 8.42 (t, J5.82 Hz,

12、 2H, H7), 8.20 (d, J1.60 Hz, 2H, H3), 7.40 (d, J1.96 Hz, 2H, H1), 3.85 (s, 6H, H4), 3.28 (t, J6.34Hz, 4H, H8), 2.65 (t, J6.33 Hz, 4H, H9), 2.58 (s, 4H, H11), 2.01 (t, J7.10 Hz, 2H, H10), IR (KBr) : 3276.46(NH), 3137.79 (NH), 2931.3 (CH), 2839.40 (CH), 1655.48 (CO), 1558.00 (NH), 1532.03 (CC),1500.64

13、 (CC), 1422.45 (NCH3, CN), 1310.92 (C NO2, CN), 1211.63 (CONH, CN), 1144.35 (CH2 NH, CN), 1107.02 (CH2NH, CN), 852.22 (C NO2, C N), 813.63 (N H), 751.12 (N H), 707.20浓度的 NiSO4 水溶液的摩尔电导率为 219 Scm2mol ,1由结果分析: 镍配合物和镍盐的摩尔电导率值很接近,镍盐中的镍离子与六个水分子配位形成的配合物, 内外 界阴阳离子个数比为 11, 因此多胺-吡咯镍配合物内 外界阴阳离子个数比也为 11, 说明硫酸根

14、离子未与 金属离子配位.1.3 镍配合物与 CTDNA 作用的实验方法1.3.1 吸收光谱实验在参比池和样品池中分别加入同样体积的缓冲溶 液和配合物溶液, 配合物的浓度固定为 1.0 ×10 5 mol/L, 在 200400 nm 范围内测定配合物的吸收光谱; 然后依次向参比池和样品池中滴加相同体积(数微升)的 CT DNA 溶液, 同上方法测定吸收光谱.1.3.2 NiL 对 DNA-EB 荧光光谱的影响实验固定 CT DNA 浓度为 4.05×105 mol/L, 加入一定 体积的 EB, 使 DNA 与 EB 的物质的量的比为 11, 然 后进行镍配合物对 DNA-

15、EB 复合物的荧光强度的影响 实验; 仪器条件为: 狭缝宽度: EXEm5 nm; 扫描速 度: 1500 nm/min; 激发波长: 520 nm; 发射谱范围:(NO2), 597.54 (NO2). Anal. calcd forC18H26N8O6:C48.00, N 24.88, H 5.78; found C 47.96, N 28.92, H 5.82.FAB-MS: 473.0 (MNa).邹敏等：一种新的吡咯多胺镍配合物的合成及其与 DNA 的作用研究483No. 6540700 nm5.1.3.3 荧光 Scatchard 图实验CT DNA 的浓度固定不变, 以不同物质的

16、量浓度比c(NiL)/c(CT DNA)加入配合物, 室温反应 1 h, 分别用100 µg/mL 的 EB 溶液进行滴定, 测量溶液的荧光强度. 仪器条件为: 激发波长: 520 nm, 狭缝宽度: EXEm10 nm, 发射谱范围: 540700 nm. 由荧光数据算出 r 和 r/cf (r 为键合 EB 与总的核酸浓度的比值, cf 为游离的 EB 浓度), 根据 Scatchard 方程: r/cfk(nr), 以 r/cf 对 r 作 图, 所得直线的斜率 k 即为 EB 与 DNA 的表观结合常数, 由斜率和截距算出 n 即为每个核苷酸键合 EB 的位点 数6.1.3.

17、4 CT DNA 溶液黏度测定CT DNA 浓度固定为 1.4×104 mol/L, 金属配合物 或 Ni2浓度依次增大, 温度恒定在(25±0.1) , 反应半2结果与讨论2.1 镍配合物与 CT DNA 的作用2.1.1吸收光谱吸收光谱是研究配合物与 DNA 相互作用的比较直 接的一种方法. 当配合物与 DNA 以插入方式结合时, 通常发生减色效应, 并伴有一定程度的红移, 减色效应 的程度通常与配合物和 DNA 作用的强弱有关; 当配合 物以其它模式与 DNA 作用时, 光谱的变化相对较小. 图 2 为加入 CT DNA 前后镍配合物的吸收光谱变化图, 从图中可以看出

18、, 随着 DNA 的加入, 配合物的吸收峰 伴随有减色现象, 其减色率可达到 18%, 表明配合物与 DNA 作用较强, 可能是以插入模式结合. 同时根据下列7,8:方程式计算了配合物与 DNA 的 结合常数 KbDNA/(a f) DNA/(b f) 1/Kb(b f), 式中 DNA表示 DNA 的浓度, , 和 分别代表 A/NiL、小时后, 进行测量, 以(/0)1/3 对 CNi/CDNA (NiL 或 Ni2a fbobsd自由镍配合物的摩尔吸光系数和完全结合后的配合物的摩尔吸光系数, 以DNA/(af)对DNA作图, 通过 直线的斜率和截距计算得到配合物与 DNA 的结合常数与

19、CT DNA 浓度的比值)作图, 其中 代表出现配合物或Ni2时的黏度, 代表 CT DNA 单独存在时的黏度, 测0试液的相对黏度计算公式 (tt0)/t0, 其中 t0 为缓冲液流经毛细管所需的时间, t 为 DNA 溶液(或含浓度不等的NiL-DNA 或 Ni2-DNA 溶液)流经毛细管所需的时间.1.4 镍配合物与 pBR322 DNA 的电泳实验用 5 mmol/L Tris-HCl (pH 7.50, 5 mmol/L NaCl)缓 冲溶液配制一定浓度的配合物溶液, 加入 0.7 µL 的 pBR322 DNA (0.5 µg/µL), 总体积为 20

20、 µL, 混匀后, 分 别在一定温度下恒温水浴反应 5 h, 通过加入 EDTA 和 溴酚蓝终止反应, 然后琼脂糖凝胶电泳分析配合物切割 DNA 的结果.1.5 MTT 实验通过 MTT 法进行镍配合物抗肝癌活性的体外筛选. 将肝癌细胞 HepG2 以 5×104 个/mL 接种于 96 孔板中, 每孔加 200 µL, 培养液为含 10%的 FBS, 5000 U/L 青霉 素、5000 U/L 链霉素的 DMEM 培养基. 在 37 , 5% CO2 的条件下培养. 将合成的配合物溶解于 DMSO 中配成10 mmol/L 母液, 用培养液配成终浓度分别为 6

21、.3, 12.5,25, 50, 100, 200, 400, 800 µmol/L 的加药培养基. 细胞在96 孔板中培养 24 h 后, 吸去上清, 换成各浓度的加药培 养基, 继续培养 72 h. 弃培养基, 每孔加入 100 µL 含 0.5 mg/mL MTT 的培养液, 再孵育 3 h. 弃上清, 每孔加 100µL DMSO, 充分混匀, 在酶标仪上测 570 nm 处的吸光 值. 阳性对照药物采用顺铂(Cisplatin) 和 5- 氟尿嘧啶 (5-FU). 实验至少重复 2 次, 抑制率(%)(1T/C)×100%, 其中 T, C 分

22、别表示实验孔和空白对照孔的吸光 值, 采用 CalcuSyn 软件计算半数抑制浓度(IC50).51Kb 为 2.18×10 (Lmol ).图 2 不同浓度 CT DNA 条件下 NiL 的作用的吸收光谱Figure 2 Absorption spectra of NiL in the presence of various concentration of CT DNA(1) c(DNA)/c(NiL)0; (2) c(DNA)/c(NiL)0.04; (3) c(DNA)/c(NiL)0.12;(4) c(DNA)/c(NiL)0.2; (5) c(DNA)/c(NiL)0.2

23、7484化 学 学 报Vol. 68, 20102.1.2NiL 对 DNA-EB 荧光光谱的影响图 3 为配合物与 DNA-EB 体系作用的荧光光谱图, 从图 中可以看出 : 随着配合 物浓度的不 断增加 , DNA-EB 复合物的荧光明显发生淬灭. EB 能专一性地插 入 DNA 双螺旋或二螺旋内部的碱基对之间, 使荧光显 著增强, 当 EB 从碱基对中被挤出来或双螺旋减少时, 荧光发生淬灭, 因而可用作结构探针. 根据图 3 说明配 合物与 DNA 在溶液中靠近时, 可能是吡咯环插入到 DNA 双链之间而挤出一部分 EB, 从而导致荧光淬灭, 由此说明配合物可能是以插入方式与 DNA 结

24、合. 由于 导致荧光淬灭的原因较多, 是否确实是因为镍配合物插 入 DNA 后而影响了 DNA-EB 体系的荧光淬灭, 还需用 荧光 Scatchard 图作进一步地验证.图 4 不同浓度 NiL 条件下 EB 与 DNA 作用的荧光 scatchard图Figure 4 Fluorescence satchard plots for binding of EB to DNAin the presence of various concentration NiL(1) c(NiL)/c(DNA)0; (2) c(NiL)/c(DNA) 0.025; (3) c(NiL)/c(DNA) 0.12

25、52.1.4粘度实验粘度测定一般被认为是确定键合模式最有力的证 据之一, 粘度对分子长度变化非常敏感, 当小分子配合 物以插入模式与 DNA 作用时, DNA 相邻碱基对的距离 会增大以容纳插入的配体, 导致螺旋伸长, DNA 溶液的 粘度增加; 当配合物以静电或沟面结合等非插入模式与 DNA 作用时, DNA 溶液的粘度无明显变化; 而以部分 插入方式与 DNA 作用时, 则可能使 DNA 的双螺旋扭NiL 的作用的图 3 不同浓度 NiL 条件下 DNA-EB 复合物体系荧光发射光 谱Figure 3 Fluorescence emission spectra of DNA-EB comp

26、lex in various concentration of NiL(1) No NiL; (2) 1 µmol/L NiL; (3) 2 µmol/L NiL; (4) 5 mol/L NiL; (5) 10mol/L NiL; (6) 20 mol/L NiL; (7) 25 mol/L NiL7结, 使其分子粘度减小 . 从图 5 可以看出, 镍离子加入CT DNA 溶液中, 随着离子浓度的增大, DNA 粘度值逐 渐减小, 可能是水合镍离子物部分插入同时伴有静电结合方式与 DNA 作用的结果; 镍配合物加入 CT DNA 溶 液中, 随着配合物浓度的增大, DNA

27、 粘度值逐渐增加,据此排除了配合物中可能残留的金属离子对 DNA 粘度 变化的影响, 由此可确定配合物是以插入方式与 DNA2.1.3荧光 Scatchard 图荧光 Scatchard 图是研究配合物与 DNA 作用方式的 一种非常重要的实验方法, 参考文献6, 以 r/cf 对 r 作 图, 绘制出荧光 Scatchard 图 4. 通常当药物以插入方式 与 DNA 键合时, 药物与 EB 对 DNA 上同一位点的结合 是竞争性的, 则 k 值变化, n 值不变; 当药物以静电方式 与 DNA 结合时, 药物与 EB 对 DNA 上不同位点的结合 是非竞争性的, 则 n 值变化, k 值不

28、变; 当药物与 DNA 的结合存在插入和非插入两种方式时, k 和 n 都变化9. 从图 4 可以看出, 随着 DNA 溶液中配合物浓度的增大, k 值逐渐减小, 计算得到 n 值在 0.190 附近, 变化不大, 这说明配合物是以竞争方式来抑制 EB 与 DNA 的结合, 即配合物以插入方式与 DNA 结合.作用的,此结论与吸收光谱、荧光光谱实验结果一致.图5 NiL或Ni2对DNA黏度的影响Effect of NiL or Ni2 on the relative viscosity ofFigure 5DNA邹 敏等：一种新的吡咯多胺镍配合物的合成及其与 DNA 的作用研究485No. 6

29、2.2 镍配合物与 pBR322 DNA 的作用琼脂糖凝胶电泳研究了反应温度在 3755 之间 配合物切割 pBR322 DNA 的情况如图 6, 反应温度超过55 的情况没有显示在图中, 因 DNA 在该条件下将发 生热变性而沉淀在胶孔中. 由电泳图分析, 反应温度低 于 50 时, DNA 切割效果不佳; 当反应温度在 5055之间时 CCC 带(超螺旋 DNA)可以完全切割为 OC 带 (缺刻 DNA), 由此说明配合物切割 DNA 合适的反应温 度范围在 5055 之间. 在上述研究的基础上, 进一步研究 50 时不同浓度配合物切割 pBR322 DNA 的情 况如图 7, 发现随着配

30、合物浓度的不断增大, CCC 带的 量逐渐减少, OC 带的量逐渐增加, 当配合物浓度达到0.5 mmol/L 时, 可将大部分 CCC 带切割为 OC 带. 由此 说明配合物在较低的浓度下, 表现出较好的切割 DNA 的活性, 是一种较好的化学核酸酶.细胞的体外抑制活性. 与阳性对照药物 Cisplatin 和 5FU对比, 配合物对 HepG2 肝癌细胞的体外抑制活性强于5FU, 而弱于 Cisplatin, 说明镍配合物具有一定的抗肝 癌活性.图 8 镍配合物对 HepG2 肝癌细胞的体外活性Figure 8 Cytotoxicity against HepG2 liver-cancer

31、 cell of nickel complex表 1 药物对 HepG2 肝癌细胞的 IC50 测定值Table 1IC50 measurementsof drugsagainstHepG2liver-cancer cellIC50Drug/(µmolL1)24 h48 h72 h图 6 不同温度下 NiL 对 pBR322 DNA 切割的琼脂糖凝胶电泳图Figure 6 Agarose gel electrophoresis patterns for the cleavage of pBR322 DNA by NiL at various temperatureLane 1: DN

32、A 37 ; Lane 2: DNANiL 37 ; Lane 3: DNANiL 45 ;Lane 4: DNANiL 50 ; Lane 5: DNANiL 55 ; CCC: supercoiled; OC: nicked; cleavage condition: 0.60 mmol/L NiLNi-LCisplatin5FU32870.91040039028.8550020339.9540与阳性对照药物对比,分析镍配合物抗肿瘤活性的可能机理如下. 5FU 可抑制胸腺嘧啶核苷合成酶, 从而干扰 DNA 的生物合成, 还主要杀灭细胞增值周期中的 S 期, 但不是典型的细胞周期特异性药物;

33、而 Cisplatin 在体内先将氯解离, 然后与 DNA 上的碱基共价结合, 形成双链间的交叉联接或单链内两点的联结而破坏 DNA 的结构和功能, 属细胞周期非特异性药物. 电泳实 验表明镍配合物可以使超螺旋 DNA 断裂成缺刻产物, 从而直接破坏 DNA 的结构, 其作用机理可能类似于 Cisplatin, 属细胞周期非特异性药物. Cisplatin 是目前实 体肿瘤的一线治疗药物, 在肿瘤的化学治疗上被广泛使 用, 因此进一步优化镍配合物的结构, 将可能获得更好 的抗肿瘤活性, 成为类似 Cisplatin 的抗肿瘤药物, 用于 实体肿瘤的化学治疗.图 7 50 不同浓度 NiL 对

34、pBR322 DNA 切割的琼脂糖凝胶电泳图Figure 7 Agarose gel electrophoresis patterns for the cleavage of pBR322 DNA by various temperature NiL at 50 Lane 1: no NiL; Lane 2: 0.05 mmol/L NiL; Lane 3: 0.10 mmol/L NiL; Lane 4:0.25 mmol/L NiL; Lane 5: 0.50 mmol/L NiL; CCC: supercoiled; OC: nicked2.3 配合物抗肝癌活性通过 MTT 法测定了不同

35、浓度的镍配合物在不同的 作用时间下对 HepG2 肝癌细胞的抑制效果, 来确定配 合物的体外抗肝癌活性, 测定结果见图 8 和表 1. 结果 显示: 在低浓度时镍配合物对 HepG2 肝癌细胞的增殖 没有表现出明显的抑制作用; 进一步增大配合物浓度, 体外抑制活性逐渐增强, 当药物作用时间分别为 24, 48 和 72 h 时, 其 IC50 测定值分别为 328, 390 和 203 µmol/L, 说明恰当延长作用时间可以提高配合物对 HepG2 肝癌3结论合成了一种新的三乙基四胺-吡咯镍金属配合物,通过多种手段对其结构进行了表征. 紫外、荧光、黏度 等方法对其与 CT DNA 的作用方式进行了研究, 发现 CT DNA 的加入使配合物吸收光谱发生减色效应; 配合 物的加入导致EB-DNA 发生荧光淬灭; 随着配合