SYBRGreenI荧光定量PCR

1、实时荧光定量PCR的应用 杨阳 2.11-08-31主要内容第一部分：PCR简介第二部分：RNA的提取第三部分：RT第四部分：实时荧光定量PCR第五部分：数据分析第六部分：误差校正第七部分：常见问题分析第一部分：PCR简介PCR技术的发明vv 1985 1985年年Kary.B.MullisKary.B.Mullis教教授发明了具有划时代意义的授发明了具有划时代意义的PCRPCR技术。技术。PCR Polymerase Chain Reaction vvPCR (PCR (聚合酶链式反应聚合酶链式反应) )技术是一种体外快速扩技术是一种体外快速扩增特定增特定DNADNA片段的方法。片段的方法。

2、 vv 是一个在引物介导下反复进行热变性、退火、是一个在引物介导下反复进行热变性、退火、引物延伸三个步骤而扩增引物延伸三个步骤而扩增DNADNA的循环过程。的循环过程。 vv运用运用PCRPCR技术能快速特异地扩增所希望的目的技术能快速特异地扩增所希望的目的DNADNA片段，使皮克片段，使皮克(Pg(Pg，10101212）起始物达到）起始物达到微克（微克（gg，10106 6）水平。）水平。2.PCR原理PCR类型 RT-PCR 兼并引物PCR 巢式PCR 反向PCR 不对称PCR 原位PCR 重组PCR 荧光定量PCR 锚定PCR 多重PCR 定量PCR 实时荧光定量PCR技术real-t

3、ime fluorescent quantitativePCRFQ-PCR 是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR从定性到定量的飞跃。 实时荧光定量PCR技术分类 荧光探针 Beacon法：以美国人Tagyi为代表 TaqMan探针:以美国ABI公司为代表 FRET技术:以罗氏公司为代表 荧光染料 饱和荧光染料: EvaGreen、LC Green 非饱和荧光染料:SYBR Green 第二部分：RNA的提取提RNA基本步骤标本Trizol异丙醇75%乙醇DEPC水溶解氯仿RNA的抽提注意事项

4、 所有用具去RNase处理 戴口罩、帽子，勤换手套，防外源RNase污染 尽量快速 4 离心：室温会导致不适当分层，从而导 致变异RNA产物。一、标本的处理 新鲜、低温保存、避免反复冻融。易至RNARNA降解，提取量下降。二、匀浆：TrizolTrizol 裂解细胞，使核蛋白体解离，释放RNARNA；抑制RNaseRNase活性；酸性酚使RNARNA进入水相。 过多：上清液变为红色，浪费。 过少：未加氯仿前即分层。 裂解不充分， RNaseRNase抑制不充分，得率低，RNARNA完整性、纯度受损。三、抽提、分层：氯仿 变性蛋白，抽提去除过多的酚，加速有机相与水相的分层。 过少：上述作用减弱，

5、影响RNA质量。 过多：使DNA和蛋白进入水相，影响RNA质量。四、沉淀：异丙醇 过多：会沉淀盐和其他污染物，使用乙醇不能洗脱。五、洗涤： 75%75%乙醇 去盐作用，根据情况可重复几次。六、溶解： DEPCDEPC水 掌握溶解时间。 太早：沉淀物太湿，含有乙醇会影响后续反应。 太迟：沉淀物太干，不易溶解。 RNA的抽提注意事项标本Trizol异丙醇75%乙醇DEPC水溶解氯仿4：过夜-70 ：一个月4：过夜-20 ：时间长会使盐沉淀 4：1周-20 ：1年 -70 ：1年以上RNA得率检测分光光度计 260nm:核酸 280nm:蛋白等有机体 230nm:杂质浓度 320nm:溶液浑浊度总R

6、NA浓度（ng/l） =OD26040稀释倍数（ng/l） OD 260读数介于0.11.0之间可靠 （203200 ng/l ）RNA的质量RNA的质量 RNA完整性鉴定 第三部分：RT RT反应体系RNA 1gPrimer 1L5Reaction Buffer 4L RNase inhibitor（20U/L） 1L10mM dNTP mix 2L Reverse Transcriptase（200U/L)1LDEPC-treated water up to 20L RT引物的选择是一系列寡核苷酸片段是一系列寡核苷酸片段的混合物，它含有各种的混合物，它含有各种可能的核苷酸排列顺序，可能的核

7、苷酸排列顺序，因此可与任意核酸序列因此可与任意核酸序列杂交。杂交。RT反应条件 25,5min ；(随机引物加此步) 42,60min； 70,5min。RT反应的注意事项冰上操作冰上操作配制混合液配制混合液试剂短暂离心试剂短暂离心移液枪：用完之后要归到最大计量的位移液枪：用完之后要归到最大计量的位 置，防止久而久之弹簧失去弹性置，防止久而久之弹簧失去弹性 。 第四部分：实时荧光定量PCRSY法-PCR反应基本组分vv DNA Polymerase DNA DNA Polymerase DNA聚合酶聚合酶vv dNTP dNTP 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸v Buffer Buffer 缓冲

8、溶液缓冲溶液v rox rox 内参染料内参染料v SYBR Green SYBR Green 荧光染料荧光染料vv Primer F/R Primer F/R 引物（上游引物（上游/ /下游）下游）vv Template Template 模板模板MixPCR实验操作注意事项vv冰上操作冰上操作vv配制混合液配制混合液vv试剂短暂离心试剂短暂离心vv防止污染：分区操作防止污染：分区操作vv移液枪：用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性移液枪：用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性 。PCR反应条件 95，10min； 95，15sec， 60，30sec， 7

9、2，30sec， 反应结束后，立即进行溶解曲线分析。 95，15sec， 60，60sec， 95，15sec， 60，15sec。for 40 cycles 第五部分：数据分析结果： 扩增曲线扩增曲线 熔解曲线熔解曲线标本阴性阴性标本理论扩增曲线理论扩增曲线实际扩增曲线实际扩增曲线PCR扩增曲线RnRn（Normalized reporterNormalized reporter）：是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光）：是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。发射强度的比值。 RnRn：RnRn是是RnRn扣除基线后得到的标准化结果（扣除基线后得到的标准化结果（

10、Rn=Rn-Rn=Rn-基线）。基线）。TmTm值：双链DNA解链50%的温度。数据分析：相对定量：不用得到绝对的拷贝数，只需计算表达差异相对定量：不用得到绝对的拷贝数，只需计算表达差异即可，得到的结果是某基因表达水平升高了或降低了即可，得到的结果是某基因表达水平升高了或降低了多少倍。多少倍。2 -CT 表示实验组目的基因表达相对于对照组变化的倍数。表示实验组目的基因表达相对于对照组变化的倍数。 Ct =Ct 目的- Ct 内参 Ct = Ct实验组- Ct 对照组 第六部分：误差校正 模板方面的误差模板方面的误差：IPC校正 取样量即细胞数量、抽提效率、纯化损失、反转录效率等 操作误差操作误

11、差：ROX校正 试剂取用误差的主要部分、受耗材质量及仪器等影响而产生的荧光激发波动 其余误差其余误差：统计校正 重复实验，取平均值总结 设计合格的引物。设计合格的引物。 适当浓度的模板。适当浓度的模板。 设定内参和阴性对照。设定内参和阴性对照。 使用合适的使用合适的ROX。 实验时做复孔。实验时做复孔。 冰上操作。冰上操作。第七部分：常见问题分析问题1：无 Ct 值出现检测荧光信号的步骤有误: 一般 SG 法采用 72延伸时采集。引物或探针降解: 可通过 PAGE电泳检测其完整性。 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的

12、情况。问题2： Ct 值出现过晚 扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三 步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。 PCRPCR 产物太长: 一般采用 80-150bp 80-150bp 的产物长度。PCRPCR 各种反应成分的降解或加样量的不足。 模板量低。问题3：阴性对照有信号MixMix或水被污染。如使用ROXROX校正，则可能为ROX ROX 降解所致。引物二聚体的出现：3535循环后出现属正常，配合熔解曲线进行分析 提高退火温度；降低引物浓度；冰上操作；重新设计引物 问题4：溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。 引物

13、浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。 模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组 DNA的引入，或通过引物设计 避免非特异扩增。cDNAcDNA为为1 1：5 5 引物终浓引物终浓100nm100nmcDNAcDNA为为1 1：5 5 引物终浓引物终浓50nm50nm问题5：重复性差1.加样不准确。 2.仪器在样品上温度条件有差异，即温度均一性不好。 3.模板浓度低。样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。 问题6：熔解曲线只有上升支扩增产物的Tm值较高，设置熔解曲线时改9595度为9999度。99.0问题7：扩增曲线异常基线设置有误。高浓度的模板会导致CTCT值过早出现，即基线范围变小，导致机器读取荧光数值有误。问题8：扩增熔解曲线不同，ct值却相同模板起始浓度相同，扩增效率不同。问题9：ct值不同，熔解曲线同，扩 增曲线还高模板起始浓度不相同，扩增效率基本相同。问题10：预实验时为单峰，正式时为杂峰。cDNA为为1：5 引物终浓度引物终浓度50nmcDNA为为1：10 引物终浓度引物终浓度50nmcDNA为为1：5 引物终浓度引物终浓度100nmcDNA为为1：5 引物终浓