第一章生物大分子的制备

1、生物大分子物质的制备生物大分子物质的制备第二节 材料的选择与处理制备的一般过程和原则制备的一般过程和原则注意事项注意事项确立有效成分的测定方法确立有效成分的测定方法材料的选择和预处理材料的选择和预处理细胞的破碎和细胞组分分离细胞的破碎和细胞组分分离有效成分的抽提有效成分的抽提有效成分的纯化和浓缩有效成分的纯化和浓缩层析法层析法 电泳法电泳法 超离心法超离心法 透析和超滤透析和超滤盐析（盐析（硫酸铵盐析硫酸铵盐析）等电等电点点沉淀沉淀有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀离心离心前处理前处理 粗分级粗分级 细分级细分级 材料选择与处理材料选择与处理细胞破碎（机械破细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、碎、溶账和自溶

2、、酶解、化学处理）酶解、化学处理）生物组织生物组织 提取液提取液 粗产品粗产品结晶结晶分子大小分子大小溶解度溶解度电荷性质电荷性质吸附性质吸附性质生物亲和力生物亲和力依据原理依据原理控制适当的控制适当的pH控制低温控制低温注意提取过程中的溶液环境注意提取过程中的溶液环境防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚 基基基本原则：防止生物分子变性、降解基本原则：防止生物分子变性、降解一一. .选择材料及预处理选择材料及预处理 l 动物，植物，微生物都可作为制备生物大分子的原材料，所动物，植物，微生物都可作为制备生物大分子的原材料，所选用的材料主要依据试验目的来确定。选用的

3、材料主要依据试验目的来确定。l 有效成份有效成份是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有效是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有效成分以外的其它物质则统称杂质。成分以外的其它物质则统称杂质。l 在动、植物和微生物材料中，有效成分的含量一般较少。如在动、植物和微生物材料中，有效成分的含量一般较少。如胰脏中胰岛素的含量小于其鲜重的百万分之一；稳定性较差，胰脏中胰岛素的含量小于其鲜重的百万分之一；稳定性较差，大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感；易大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感；易被微生物分解变质。被微生物分解变质。l 总的来说，材料选择应遵循的原则是，总的来说，

4、材料选择应遵循的原则是，有效成分含量多、稳有效成分含量多、稳定性好；来源丰富、保持新鲜；提取工艺简单、有综合利用定性好；来源丰富、保持新鲜；提取工艺简单、有综合利用价值等。价值等。 1.1.动物组织：动物组织： 选材选材：必须选择有效成分含量丰富且易分离的脏器组织为：必须选择有效成分含量丰富且易分离的脏器组织为原材料。如磷酸单酯酶，从含量看，虽然在胰脏、肝脏和原材料。如磷酸单酯酶，从含量看，虽然在胰脏、肝脏和脾脏中较丰富，但是因其与磷酸二酯酶共存，进行提纯时，脾脏中较丰富，但是因其与磷酸二酯酶共存，进行提纯时，这两种酶很难分开。所以实践中常选用含磷酸单酯酶少，这两种酶很难分开。所以实践中常选用

5、含磷酸单酯酶少，但几乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。但几乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。 脱脂脱脂：脏器中含量较高的脂肪，容易氧化酸败，导致原料：脏器中含量较高的脂肪，容易氧化酸败，导致原料变质影响纯度操作和制品得率。常用的脱脂方法有：人工变质影响纯度操作和制品得率。常用的脱脂方法有：人工剥去脏器外的脂肪组织；浸泡在脂溶性的有机溶剂（丙酮，剥去脏器外的脂肪组织；浸泡在脂溶性的有机溶剂（丙酮，乙醚）中脱脂；采用快速加热（乙醚）中脱脂；采用快速加热（5050左右），快速冷却的左右），快速冷却的方法，使溶化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去。方法，使溶化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去。 保存保存：对预处

6、理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保：对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存。存。 a a. .冰冻冰冻：剥去脂肪和筋皮等结缔组织，短期保存：剥去脂肪和筋皮等结缔组织，短期保存：1010的冰箱内；长期保存：的冰箱内；长期保存：7070低温冰箱内。低温冰箱内。 b.b.干燥干燥：对于像脑垂体一类小组织，可置丙酮液中：对于像脑垂体一类小组织，可置丙酮液中脱水，干燥后磨粉储存备用；对于含耐高温有效成分（如：脱水，干燥后磨粉储存备用；对于含耐高温有效成分（如：肝素）的肠粘膜，可在沸水蒸煮处理，烘干后能长期保存。肝素）的肠粘膜，可在沸水蒸煮处理，烘干后能长期保存。 冰箱的除霜冰箱的除霜循环循环

7、，可能，可能对细胞对细胞造成造成伤害伤害，要特別小，要特別小心。心。解冻时解冻时要越快越好，但避免局部要越快越好，但避免局部过热过热。2.2.植物材料：植物材料： 选材选材：注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生：注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。种子物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。种子须泡胀或粉碎才可使用。含油脂较多的也要进行脱脂处须泡胀或粉碎才可使用。含油脂较多的也要进行脱脂处理。理。 a.a.提取核提取核DNADNA：选用黄化苗（生长：选用黄化苗（生长7 71010天小麦，水天小麦，水稻），防止叶绿体稻），防止叶绿体DN

8、ADNA的干扰的干扰 b.b.提取提取RNARNA：根据实验目的选用生长幼嫩组织为好。：根据实验目的选用生长幼嫩组织为好。 保存保存：冷冻采样后尽快放于：冷冻采样后尽快放于420420冰箱内。冰箱内。 DNA,RNA DNA,RNA 采样后，采样后，N N2 2速冻，至速冻，至7070冰箱。对冰箱。对RNARNA样，如样，如不立即使用，冷冻保存尤为重要。不立即使用，冷冻保存尤为重要。3.3.微生物：微生物： 选材选材：应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和：应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生

9、物为材料时有两种情况：两种情况： a.a.利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等。一般用离心法收集上清液，上清液只能在低温下短酶等。一般用离心法收集上清液，上清液只能在低温下短期保存期保存 b.b.利用菌体含有的生化物质，如：蛋白质，核酸和胞利用菌体含有的生化物质，如：蛋白质，核酸和胞内酶等。需破碎菌体细胞分离，湿菌体可低温短期保存，内酶等。需破碎菌体细胞分离，湿菌体可低温短期保存，冻干粉可在冻干粉可在44保存数月。保存数月。 3.3. 有效成分在原材料中含量较低，纯化是使其纯度有效成分在原材料中含量较低，纯化是使其纯度增高的过程，因此，提

10、取和分离的每个步骤均要测定增高的过程，因此，提取和分离的每个步骤均要测定有效成分的含量有效成分的含量. .。n测定方法要求测定方法要求: : 专一、准确、灵敏和简便专一、准确、灵敏和简便。n使用较多的测定方法有使用较多的测定方法有光谱法光谱法（包括紫外光谱法、（包括紫外光谱法、可见光光可见光光谱法、谱法、荧光光谱法等）荧光光谱法等） 、生物活性、生物活性( (如酶活力、激素活性如酶活力、激素活性) )测测定、电泳分析等，有时可用电化学法和免疫分析法。定、电泳分析等，有时可用电化学法和免疫分析法。不同的生物体细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，不同的生物体细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相

11、同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎。植物和微生物由于如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎。植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。的细胞破碎方法。常用方法：常用方法：细胞结构：细胞壁、细胞膜、细胞质和核区。细胞结构：细胞壁、细胞膜、细胞质和核区。所要物质可存在细胞外（胞外酶）和细胞内（胞内酶）所要物质可存在细胞外（胞外酶）和细胞内（胞内酶）用脂溶性的溶剂用脂溶性的溶剂( (如丙酮、氯仿、甲苯如丙酮、氯仿、甲苯) )或表面活性剂或表面活性剂( (如十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠如十二烷基磺酸钠、十二

12、烷基硫酸钠) ) 处理细胞时，可将处理细胞时，可将细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类或类或DNADNA等物质，并导致整个细胞破碎。等物质，并导致整个细胞破碎。 生物酶生物酶( (如如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶) )有降解细菌细胞壁有降解细菌细胞壁的功能。在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而的功能。在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。 例如：例如：从某些细菌细胞提取质粒从某

13、些细菌细胞提取质粒DNADNA时，不少方法都采用了加时，不少方法都采用了加溶菌酶溶菌酶( (来自蛋清来自蛋清) )破坏细胞壁的步骤。当有些细菌对溶菌酶不破坏细胞壁的步骤。当有些细菌对溶菌酶不敏感时，可加巯基乙醇（敏感时，可加巯基乙醇（MEME）或者）或者8mol/L8mol/L的尿素，以促进细胞的尿素，以促进细胞壁的消化。另外，也可加入蛋白酶壁的消化。另外，也可加入蛋白酶K K来提高破壁效果。来提高破壁效果。 而在破坏酵母菌的细胞时，可采用蜗牛酶进行。一般对数而在破坏酵母菌的细胞时，可采用蜗牛酶进行。一般对数期的酵母细胞对该酶较敏感。将酵母细胞悬于期的酵母细胞对该酶较敏感。将酵母细胞悬于0.1

14、mol/L0.1mol/L柠檬酸柠檬酸/ /磷酸氢二钠缓冲液磷酸氢二钠缓冲液(pH5.4)(pH5.4)中，加入中，加入1%1%蜗牛酶，蜗牛酶， 在在3030处理处理3030分钟，即可使大部分细胞壁破裂，如同时加入分钟，即可使大部分细胞壁破裂，如同时加入0.2%0.2%巯基乙醇巯基乙醇效果更好。效果更好。 四、四、 生物酶降解法生物酶降解法 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提稀盐溶

15、液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。取蛋白质和酶最常用的溶剂。 在抽提阶段，在抽提阶段，pH值、金属离子、溶剂的浓度和极性值、金属离子、溶剂的浓度和极性等等因子，可明显影响有效成分的性质和数量。因此选择抽提液因子，可明显影响有效成分的性质和数量。因此选择抽提液必须考虑这些因素。必须考虑这些因素。1、溶剂的极性和离子强度：、溶剂的极性和离子强度： 有些生物大分子在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些有些生物大分子在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。例如提取刀豆球蛋则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。例如提取刀豆球蛋白白A时，

16、用时，用0.15mol/L甚至更高浓度的甚至更高浓度的NaCl溶液，都可使其从溶液，都可使其从刀豆粉中溶解出来，稳定存在。而抽提脾磷酸二酯酶时，则刀豆粉中溶解出来，稳定存在。而抽提脾磷酸二酯酶时，则需用需用0.2 mol/L蔗糖水溶液。蔗糖水溶液。 一种物质溶解度大小与溶剂性质密切相关（相似相溶原理）；一种物质溶解度大小与溶剂性质密切相关（相似相溶原理）；离子强度通过影响溶质的带电性也影响溶质的溶解度。降低离子强度通过影响溶质的带电性也影响溶质的溶解度。降低极性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亚砜，二甲基甲酰氨。极性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亚砜，二甲基甲酰氨。提高离子强度方法：在水溶液中加

17、中性盐（提高离子强度方法：在水溶液中加中性盐（KCl,NaClKCl,NaCl, , NHNH4 4Cl,(NHCl,(NH4 4) )2 2SOSO4 4）。一般离子强度较低的中性盐溶液可促）。一般离子强度较低的中性盐溶液可促进蛋白溶解（盐溶），保护蛋白质活性；高离子强度的中进蛋白溶解（盐溶），保护蛋白质活性；高离子强度的中性盐可引起蛋白质沉淀，发生盐析作用。性盐可引起蛋白质沉淀，发生盐析作用。高离子强度使高离子强度使DNADNA溶解度增加；低离子强度使溶解度增加；低离子强度使RNARNA溶解度增溶解度增加（核酸分离依据）。加（核酸分离依据）。常用的盐溶液是常用的盐溶液是NaClNaCl溶液

18、，浓度以溶液，浓度以0.15mol/L0.15mol/L为宜。但是为宜。但是在提取核蛋白或细胞器中的蛋白质时，为促使蛋白质与核在提取核蛋白或细胞器中的蛋白质时，为促使蛋白质与核酸、蛋白质与细胞酸、蛋白质与细胞器分离，则宜用高浓度器分离，则宜用高浓度(0.5-2.0mol/L)(0.5-2.0mol/L)的盐溶液。的盐溶液。 蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。值有关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=68范围内范围内.但有时根据情况而定，例如肝素在酸范围不稳定而且不易但有时根据情况而定，例如肝素在酸范围不稳定而

19、且不易与脂蛋白分开，才采用与脂蛋白分开，才采用pH10.5-11的高碱性溶液提取。的高碱性溶液提取。 4 4、水解酶、水解酶 细胞破裂后，许多水解酶释放出来。水解酶与欲抽提细胞破裂后，许多水解酶释放出来。水解酶与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，的蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。为此，必须采用导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。为此，必须采用加入加入抑制剂、调节抽提液的抑制剂、调节抽提液的pHpH、离子浓度或极性、离子浓度或极性等方法，等方法，使这些酶丧失活性。使这些酶丧失活性。 如：提取，纯化胰岛素时，为阻止胰蛋白酶活

20、化，采如：提取，纯化胰岛素时，为阻止胰蛋白酶活化，采用用6868的乙醇溶液（的乙醇溶液（pH2.5-3.0,pH2.5-3.0,用草酸调节），在用草酸调节），在13131515抽提抽提3h3h，可得到较高的回收率。因为，可得到较高的回收率。因为6868乙醇可使胰乙醇可使胰蛋白酶暂时失活，草酸可除去蛋白酶的激活剂蛋白酶暂时失活，草酸可除去蛋白酶的激活剂CaCa2+2+，酸性环，酸性环境也抑制酶蛋白活性。境也抑制酶蛋白活性。 RNARNA提取需防止提取需防止RNaseRNase的水解作用，的水解作用，RNaseRNase活性很高，很活性很高，很容易使容易使RNARNA降解，所以每一步都严格控制降解

21、，所以每一步都严格控制RNaseRNase，可采用，可采用DEPCDEPC（焦碳酸二乙脂）处理，带手套操作，提取液中加强（焦碳酸二乙脂）处理，带手套操作，提取液中加强的变性剂异硫氰酸胍等措施。的变性剂异硫氰酸胍等措施。 5 5、搅拌、搅拌 搅拌能促使欲抽提物与抽提液的接触，并能增加溶解度。搅拌能促使欲抽提物与抽提液的接触，并能增加溶解度。但是，一般宜采用温和的搅拌方法但是，一般宜采用温和的搅拌方法 ，速度太快时容易产生，速度太快时容易产生泡沫，导致某些酶类变性失活。泡沫，导致某些酶类变性失活。6 6、氧化、氧化 一般蛋白质都含相当数量的巯基，该基团常常是酶和蛋一般蛋白质都含相当数量的巯基，该基

22、团常常是酶和蛋白质的必须基团，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使白质的必须基团，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶( (或蛋白质或蛋白质) )失活失活( (或变性或变性) )。在提取液中加入。在提取液中加入巯基乙醇，半胱氨酸，维巯基乙醇，半胱氨酸，维C C，二，二硫苏糖醇，还原性谷胱甘肽硫苏糖醇，还原性谷胱甘肽等还原剂，可防止巯基发生氧化，等还原剂，可防止巯基发生氧化，使蛋白酶失活。使蛋白酶失活。7 7、金属离子、金属离子 蛋白质的巯基除易受氧化剂作用外，还能和金属离子蛋白质的巯基除易受氧化剂作用外，还能和金属离子

23、如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。 这些金属离子主这些金属离子主要来源于制备缓冲液的试剂中。解决的办法：要来源于制备缓冲液的试剂中。解决的办法：用无离子用无离子水或重蒸水配制试剂；水或重蒸水配制试剂；在配制的试剂中加入在配制的试剂中加入1-3mmol/L1-3mmol/L的的EDTA(EDTA(金属离子络合剂金属离子络合剂) )。 8 8、抽提液与抽提物的比例、抽提液与抽提物的比例 在抽提时，抽提液与抽提物的比例要适当，一般以在抽提时，抽提液与抽提物的比例要适当，一般以5151为宜。如抽提液过多，则有利于有效成分的提取，但为宜。如抽提液过多，则有利于有效成分的

24、提取，但不利于纯化工序的进行。不利于纯化工序的进行。滤膜滤膜抽气抽气滤膜滤膜离心离心AB 利用压力、抽滤（利用压力、抽滤（A）或离心力）或离心力（B）等多种形式，强行使水和其它）等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。滤膜有多种规格，可选择性目的。滤膜有多种规格，可选择性的截留相对分子量不同的蛋白质。的截留相对分子量不同的蛋白质。 为了避免被膜截留的蛋白质在膜为了避免被膜截留的蛋白质在膜表面上堆积，现常用表面上堆积，现常用截向流过滤截向流过滤的的方法，即液体在泵驱动下沿着与膜方法，即

25、液体在泵驱动下沿着与膜表面相切方向流动，在膜上形成压表面相切方向流动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部力，使部分液体透过膜，而另一部分液体切向地流过表面将被膜截留分液体切向地流过表面将被膜截留的蛋白质分子冲走。的蛋白质分子冲走。半透膜袋半透膜袋蛋白质溶液蛋白质溶液透析液透析液磁棒磁棒 磁力搅拌器磁力搅拌器 透析是利用蛋白质等大分子不透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。常用的半透膜：等分开。常用的半透膜： 玻璃纸（赛璐玢纸，玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane paper） 火绵纸（赛璐玎纸火绵纸（赛璐玎纸, celloidin paper） 其他改型纤维素材料其他改型纤维素材料样品不起泡，不暴沸。样品不起泡，不暴沸。得到的干粉样品不粘壁，易取出。得到的干粉样品不粘壁，易取出。冰干后的样品是疏松的粉末，易溶于水。冰干后的样品是疏松的粉末，易溶于水。 样品要溶于水，不含有机溶剂，否则冰点降低，样品样品要溶于水，不含有机溶剂，否则冰点降低，样品易融化，起大量泡沫，使样品变性，污染真空泵油。易融化，起大量泡沫，使样品变性，污染真空泵油。 样品要予先脱