HMGCoA还原酶抑制剂对INS1细胞RasRafERKCREB信号转导通路的影响

1、.天津医科大学硕士学位论文中文摘要 目的胰岛素抵抗和胰岛p细胞胰岛素分泌功能受损是2型糖尿病发病的两个 最重要的病理生理机制。如何最大限度地保护胰岛D细胞功能，避免糖尿病患者因使用其它药物而导致本已受损的B细胞功能进一步恶化，一直是医学界关注的焦点。目前已经证实，多种临床药物均可影响胰岛B细胞功能，影响胰岛素分泌，进而影响糖代谢。阿托伐他汀作为HMGCoA还原酶抑制剂，以其明确的调脂疗效和较好的 耐受性而广泛应用于糖尿病患者，且时间窗越来越早、应用时间越来越长、剂 量越来越大。该类药物的调脂外作用也日益受到关注，其中包括对糖尿病的影 响。近来多项临床荟萃分析发现他汀类药物使糖尿病的患病风险增加

2、，且呈药 物剂量依赖性，但具体机制尚不清楚。体内外研究证实，HMGCoA还原酶抑 制剂除具有良好的降低胆固醇水平作用外，还可通过抑制胰岛B细胞ATP敏感 K+通道和电压依从性钙通道活性而抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌，通过抑制胰 岛素启动子活性而抑制胰岛素mRNA表达。但HMGCoA还原酶抑制剂通过何 种具体机制抑制胰岛素启动子活性进而抑制胰岛素合成目前尚未见相关研究报道。HMGCoA还原酶抑制剂通过抑制甲羟戊酸代谢产物如焦磷酸法呢酯 (FPP)、焦磷酸龙牛儿基龙牛儿醇(GGPP)的合成，使依赖FPP、GGPP修饰的小 GTP蛋白如Ras和Rho不能定位于细胞膜，从而抑制细胞内信号传导。RasRa

3、纯R刚CI也B信号通路是目前比较明确的胰岛素信号通路，主要参与胰岛素的基因转录调控。由此，HMGCoA还原酶抑制剂与RasRafERKCREB 信号通路的关系值得深入探讨。本研究观察高糖刺激下阿托伐他汀干预后胰岛p细胞株INS1细胞RasRa砸砌CREB信号通路中各个关键激酶活性的变化以及细胞核转录因子CREBDNA结合活性，以明确阿托伐他汀对Ras信号转导通 路分子水平变化的影响，探讨他汀类药物抑制胰岛p细胞胰岛素启动子活性， 进而抑制胰岛素mRNA表达的作用机制。方法以胰岛B细胞株INS1细胞为模型，体外观察阿托伐他汀对INS1细胞Ras复合体途径中(Ras瓜a饱龇REB)的影响。本实验分

4、别采用Western blot、RTPCR方法检测阿托伐他汀对胰岛素信号转导通路中的Ras复合体途径中各：天津医科大学硕士学位论文关键酶(RasGTPase、p-Raf-1、p-CERB)活性变化。采用染色质免疫共沉淀法 检测阿托伐他汀对INS1细胞p-CREBDNA结合活性的影响。结果(1)高糖(25 mmolL)诱导INS1细胞Ras通路蛋白活性增加，且呈时间依 赖性。实验结果显示高糖组磷酸化Raf-1激酶表达水平与正常组比较明显增高， 随着时间的延长，磷酸化水平逐渐增加，2小时表达开始增高，64,时增高明显， 达对照组的24倍，而对Raf-1的蛋白总量影响不大。(2)阿托伐他汀呈浓度依赖

5、性抑制INS1细胞Ras通路中关键因子蛋白 p-Raf-1的活性。不同浓度阿托伐他汀处理细胞24h后，随着阿托伐他汀浓度增 加，磷酸化Raf-1表现为明显抑制，表达量逐渐减少。与对照组相比，PRaf-1 表达水平在19molL及109molL时下降不明显(尸>005)，在509molL时出 现明显降低(尸<O01)，在1009molL时阿托伐他汀组中出现较强的抑制(尸<O01)。(3)501amolL阿托伐他汀抑制INS1细胞Ras通路中关键因子蛋白的活 性。INS1细胞经高糖(25 mmolL)刺激6小时后加用509molL阿托伐他汀 处理，经Western bloting

6、检测显示，与高糖组相比，阿托伐他汀组Ras GTPase、 p-Raf-1、PCREB的蛋白表达水平均明显下降，抑制率分别为618、609、 554(P<001)。(4)本实验在基因水平检测发现各关键酶表达没有变化，高糖组Ras mRNA表达与对照组相比变化不明显，与同浓度葡萄糖组相比，阿托伐他汀组、 RasGTPase抑制剂Manumycin A组Ras mRNA表达无明显变化(胗O05)。(5)阿托伐他汀抑制INS1细胞p-CREBDNA结合活性。与对照组相比， 高糖刺激后INS1细胞p-CREBDNA结合量明显增高。与高糖组相比，阿托伐 他汀药物处理组及Manumycin A组PC

7、REBDNA结合量均明显下降(尸<O01)。结论(1)体外高糖能明显诱导胰岛13细胞株INSl细胞RasRafERKCREB信 号通路中关键酶活性增加，且呈时间依赖性。(2)阿托伐他汀浓度依赖性抑制胰岛13细胞株RasRaE砌CREB信号转天津医科大学硕士学位论文导通路RasGTPase的活性，抑制通路的激活。进一步抑制其下游分子p-Raf-1、 PCERB蛋白表达，降低INS1细胞PCREB与DNA的结合量。(3)阿托伐他汀通过抑制胰岛p细胞中Ras蛋白的翻译后修饰，抑制 RasGTPase活性，进而抑制胰岛素信号转导通路中的Ras复合体途径 (Ras依a优!砌(C狙)中各关键酶活性，

8、导致p-CREBDNA结合量降低而抑 制胰岛素启动子活性，抑制胰岛素合成。提示他汀类药物对糖尿病胰岛功能的 影响部分与其对RasRafERKCREB信号通路的抑制有关。关键词：阿托伐他汀Ras信号通路INS一1细胞胰岛素合成AbstractObjectiveInsulin resistance and pancreatic p cell impaired insulinsecreti。n are the1mponant pathophysiological mechanisms in type 2 diabetesIthasmostbeen thefocus of attention of t

9、he medical profession that howto protect islet p cen fhnctionand preVent diabetic patients fromavoiding further deterioratioll of the aJreadv1mpalreQ beta cell function·It has been confirmed that kinds ofclinical drugs canafiecl the pancreatic p cell function，insulin secretion，and further influ

10、ence91ucosemetabolismAs a3。hydroxY。3。methyl。glutarylcoenzyme A(HMGCoA)reductase inhibitoratorvastatm 1s wldely used in the treatment and prevention of diabeticpatientsbec8use of cle甜1ipid_lowering efficacy andtolerability,with the increasinglv earlvtime wlndow，the 10nger application time，and the inc

11、reasingdoseNonlipid r01e oftnese drugs IS a1SO be concerned gradually,including the impact on diabetesKecenUy，a number of clinical meta。analysis found that statins could increase the risk of diabetes with the dose-dependenceThe mechanismsare unclear and need to bestudled furtheL Results from in vitr

12、o and vivo experiments indicated thatHMGCoAreductase 1nhl bltors not only reduce cholesterollevels，but also iIlllibit 91ucose。st姗uJated insulin secretion by inhibiting the activity of thepancreatic B cell ATPsensitive Kchannel，voltage compliance calcium ch锄e1 and inhibit insulin mRNAexPresslon bY in

13、hibiting insulin promoter activity and ameliorate insulin resistance atthe s锄e timeHowever,the biological effect of HMGCoA reductase汕ibitorson1nsulln Promoter in regulating the insulin synthesis is notclearly deftnedThemechanism needs further evaluation in future prospective trialsIn the cholesterol

14、 synthetic pathway,the inhibition of HMGCoAreductaseprevenls the conVersion of HMG-CoA tomevalonate，limiting the synthesis ofcnolesterol删 itsupstream intermediatessuchasisoprenoids，famesvlgeranygeranyl pyrophosphate(vpp)and geranylgeranyl pyrophosphate(GGPP)Notably，FPP and GGPP are used as substrate

15、s for the prenylation of small GTPprotelns，1ncluding Ras，Rho·A post-translational modification that is essential forthe activation of these signaling effectors，thusenabling their critical r01es in cell|V天津医科大学硕士学位论文signal transduction pathwayThe RasRafERKCREB signaling pathway is relatively cle

16、ar insulin signaling pathway,mainly involved in the regulation of insulin gene transcriptionThus，the relationship between HMGCoA reductase inhibitors and the RasRafERKCREB signal pathway are worthy of further exploration In this study,we observed the RasRafERKCREB signaling pathway critical kinase a

17、ctivity and nuclear transcription factor CREBDNA binding activity of pancreatic p cell line INS-1 cells after the intervention of atorvastatin in high glucose，in order to identify the effect of atorvastatin on Ras signal transduction pathways at the molecular level The aim of this study was to inves

18、tigate how statins inhibit insulin promoter activity and insulin mRNA genes expression in pancreatic p cellsMethods INS一1 cell，a pancreatic p cell line，was choosed as modelThe impactofatorvastatin on the INS一1 cells Ras signal transduction pathway(RasRafERK CREB)in vitro was investigatedWestern blot

19、ting(WB)，RT-PCR were used to detect Ras signaling pathway critical kinase(RasGTPase，p-Raf-1，PCERB) expressionChromatin immuneprecipitation(ChIP)was used to detect the effect ofatorvastatin on INS··1 cells P-CREBDNA binding activityResults (1)High glucose induced the activation of Ras signa

20、ling in timedependent manner in INS一1 cellsWhether high glucose could alter protein expression in INS一1 cells was examinedCells were cultured in high glucoseThefinding revealed high glucose rapidly increased Raf-1 activation in six hours，but had no effect on total protein(2)Whether atorvastatin coul

21、d be linked to Raf-1 activation was further investigatedAtorvastatin had inhibitory effect Oil the promotion of Raf-1 activation with the concentrationdependenceCells were cultured at different concentrations ofatorvastatin for 24 hoursWith the increase inatorvastin concentration，the expression of a

22、ctive Raf-1 protein gradually decreased In comparison with the control group，l“M and l OgM atorvastatin were not detected the inhibition ofthe expression ofactive Raf-1 protein f尸>O05)500M and 100pMatorvastatin had significantly decreased the expression of active Raf-1 protein(尸<001)(3)Atorvas

23、tatin can significantly reverse the promotion of RasGTPase at the concentration of 50“M，p-Raf-1 and P·CREB protein expression were significantly decreased compared with high glucose(25 mmolL)levels，and theVinhibition ratio is 618，609and 554，respectively扩<O01)(4)Whether theJinked tohigh gluco

24、se the activation of Ras signal path protein expression waspromotion of Ras mRNA gene expression was studied finallyIn comparison with the control group，realtime PCR showed that high glucose did not increase Ras mRNA gene expressionIn comparison with the high glucose group，The Ras mRNAgene expressio

25、n of the atorvastatin group and the RasGTPase inhibitor man啪ycmAcould a士lecne group had no significant difference妒>005)(5)Atorvastatincombination of p-CREB and DNA in INS一1 cellsIn comparison wi也thecontrolwhich眦re cultu咒d group，the pCREBDNA combining wei ght of INS·1 cells ofwith atorvastatm

26、 orin high glucose was significantly increasedCells treatedman啪vcin A had reduced the p-CREBDNA combining weight(P<0·01)·Conclusions(1)Hi曲91uc。se timedependently inc：reased the activity。f critical enzyme。f the RasRafERKCREB signaling pathway in pancreatic p cell line INS-1cells(2)Atorva

27、statin statins could inhibit the activity of RasGTPase of RasRaf ERKCREB signaling pathway in pancreatic B cell lines·MoreoVer，atorvaslatln i11llibit the downstream molecules p-Raf-1，p-CERB protein expresslon·Atorvastatmstatins could reduce the binding capacity of pCREB and DNA in INS_1 ce

28、lls·(3)Atorvastatin inhibited posttranslational modification of Ras prot锄sm thep锄creatic B cells and RasGTPase activity,and futher inhibited theransduc10n ofthe Ras complex pathway of insulin signal transduction pathways(RasRafERK01CREB)1ead to the reducement of p-CREBDNA binding capacity,supp佗

29、sslonofinsulin promoter activity and inhibition of insulin synthesisTherefore，the 1mpactstatins on diabetic islet胁ction depended in part on the resistanceof RasRafERK f CREB signaling pathwayKevwords：Atorvastatin，Ras signal pathway，INS一1 cells，Insulin synthesisV缩略语符号说明英文缩写英文全称中文全称cAMPCyclic Adenosin

30、e monophosphate环磷酸腺苷cDNAComplementary DNA互补DNACHIPChromatinimmuneprecipitation染色质免疫共沉淀CREBcAMP responseelementbinding proteinscAMP反应元件结合蛋白DMSODimethyl sulfoxide二甲基亚砜EBEthidiumbromide溴化乙锭FBSFetal bovine sen lm胎牛血清FPPFarneyl pyrophosphate焦磷酸法尼酯GGPPGeranylgeranyl pyrophosphosphate焦磷酸牛儿基牛儿酯Grb2Growth fa

31、ctor receptorboundprotein 2生长因子受体结合蛋白2HMGCoA3-hydroxy3。methylglutarylcoenzyme A3-羟基一3-甲基戊二酸单酰辅酶AIPImmunoprecipitation免疫共沉淀MAPKMitogenactivated protein kinase有丝分裂原激活的蛋白激酶MVAMevalonate甲羟戊酸ODOpticaldensity光密度值PBSPhosphate buffered saline磷酸盐缓冲液RTPCRReVerse仃anscription P。lymerase逆转录聚合酶链反应chain reactionsD

32、s-PAGEsDsPolyacrylamid geJ 1ectroph。resesSDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳技术路线X天津医科大学硕士学位论文，jL-一·-：一目!J吾研究现状、成果HMG-CoA还原酶抑制剂(他汀类调脂药物)以其明显的调脂作用和良好 的耐受性而被广泛长期应用于糖尿病及非糖尿病患者合并高脂血症和动脉硬化 的预防和治疗。他汀类药物不仅能够改善糖尿病致动脉硬化血脂谱而且能够显 著降低各种糖尿病患者的心血管事件达37。目前已经证实，多种临床药物均 可影响胰岛p细胞功能，影响胰岛素分泌，进而影响糖代谢。而且，目前多项 荟萃分析证实，他汀类调脂药会增加新发糖尿病风险达9，且呈药

33、物剂量依赖 性，但是具体机制尚不清楚。由此，国际上有关该类药物对糖尿病的影响日益 受到关注【l川。我们前期实验观察到：脂溶性他汀类药物剂量依赖性抑制大鼠胰 岛p细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌，其机制与该类药物抑制ATP敏感钾通道和 电压依从性钙通道的活性有关。前期实验同时还观察到他汀类在抑制胰岛素分 泌的同时，还剂量依赖性抑制大鼠胰岛D细胞胰岛素mRNA表达，抑制胰岛素 合成，而且这种抑制作用和其对胰岛素启动子活性的抑制有关【5】，但是他汀类 药物如何具体抑制胰岛素启动子活性，目前尚不清楚。胰岛素的生物合成是一个复杂的过程，受到多种因素、多个环节的影响。 在生理浓度范围内，细胞外葡萄糖浓度的增加直

34、接刺激胰岛素启动子活性，进 而促进胰岛素转录。外源胰岛素则对胰岛素启动子活性未见影响。进步研究 还发现，胰岛素的分泌增加(如KCL的作用)或减少(如钙离子拮抗剂)均不 影响启动子活性，也不影响其对葡萄糖刺激后的敏感性。因此，推测葡萄糖是 通过影响胰岛B细胞内的信号传导而影响启动子活性，与细胞内钙离子的变化 及胰岛素分泌无直接关系。Yoriko等16J研究发现，一种蛋白激酶(特别是蛋白 激酶C，PKC)的强抑制剂Staurosporine，通过作用于cAMP反应元件(CRE)而影响胰岛素基因表达。在胰岛素信号转导中，研究较深入的主要为以下两条通路(图1)：(1)P13K 途径。(2)Ras复合体

35、途径。前者主要与胰岛素的代谢效应有关，但也涉及基因 转录；后者主要实现胰岛素的调控基因转录，促进细胞生长、增殖功能，同时 也参与代谢调节。ras基因是第一个被鉴定的人类癌基因，ras基因在进化中高 度保守，广泛存在于各种真核生物细胞中。Ras蛋白家族的三个密切相关成员天津医科大学硕士学位论文一一一。Hras、K。ras和N-ras，是在人类肿瘤中最常见的癌基因，分布于不同染色体上， 能编码Ras蛋白，其相对分子量是21kDa，故又被称为P2171。Ras蛋白锚定在 细胞膜内侧，为GTPGDP结合蛋白，当Ras与三磷酸鸟苷(GTP)结合时为有 活性状态，参与信号转导，若与二磷酸鸟苷(GDP)结合

36、时则处于无活性状态， 信号传递中止18】。在胰岛素信号转导过程中活化的胰岛素受体(IR)激活受体 底物(IRS)蛋白，后者将信号传至适配蛋白生长因子受体结合蛋白2(Grb2)， 后者再与信号蛋白GDPGTP交换因子(简称sos)相互作用，SOS进而激活 Ras。活性Ras激活Raf-1激酶(原癌基因Raf编码的丝氨酸苏氨酸激酶)，其 过程是使结合在Raf上的1433蛋白解离下来，从而使Raf被丝(苏)氨酸激 酶磷酸化。活化的Raf激酶，使丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的激酶(MAPKK， 也称MEK)上两个丝氨酸磷酸化而被激活19J。MEK再通过磷酸化效应激活 MAPK，又称“细胞外信号调节

37、的激酶”(ERK)，后者再激活90kD的核糖体S6 激酶(p90鹅“)。MAPK和p90咄参与转录因子的磷酸化激活过程，可以磷酸化 一些核内的转录因子如cfos、cJun、Elk1、cmyc、ATF2、cAMP反应元件 结合蛋白(CREB)等，诱导基因转录。CRE是广泛存在于真核生物许多基因启 动区的一段DNA序列，由于进化上的保守性，使它在基因转录的调节中也起 重要作用。CREB受p90侣k激活后，与CRE结合之后，更能大大提高CRE下游基因的转录活性。有研究发现，某些药物对胰岛素启动子活性的调节和CRE密切相关¨ 。HMGCoA还原酶抑制剂竞争性结合在酶的活性部位而抑制胆固醇的合

38、 成，除了抑制胆固醇合成外，对HMGCOA还原酶的抑制还同时减少甲羟戊酸 (mevalonate，MVA)代谢途径中的其它中间代谢产物(图2)。他汀类的调 脂外作用主要和其对中间代谢产物一MVA合成的抑制有关。HMGCOA在还原 酶作用下生成MVA，MVA进一步磷酸化和去碳酸基化，生成异戊烯焦磷酸酯 (IPP)。然后二甲基二丙烯基焦磷酸酯与IPP反应生成牛龙牛儿醇焦磷酸酯 (GPP)。GPP与IPP进一步生成焦磷酸法昵酯(FPP)。异戊烯焦磷酸和FPP 反应生成焦磷酸龙牛儿基龙牛儿醇(GGPP)。HMGCoA还原酶抑制剂可抑制 甲羟戊酸代谢产物如FPP、GGPP的合成，使依赖FPP、GGPP修

39、饰的小GTP 蛋白如Ras和Rho不能定位于细胞膜，从而抑制细胞内信号传导。胆固醇的合成主要发生在肝细胞，但原则上讲，胆固醇合成可以发生在任何 有核细胞，胰岛p细胞也不例外。而胰岛p细胞上同样存在胰岛素受体及胰岛2天津医科大学硕士学位论文素信号转导通路的其他部分如IRSs等，胰岛素对13细胞内胰岛素基因的转录、 翻译过程及胰岛素分泌起正反馈作用1 11。因此，他汀类药物对胰岛素信号转导 通路中的Ras复合体途径的抑制作用同样可以发生在胰岛B细胞。我们在前期工作基础上，结合文献报道，提出假说：HMGCoA还原酶抑 制剂可能通过抑制胰岛13细胞中Ras蛋白的翻译后修饰，抑制RasGTPase活性，

40、 进而抑制胰岛素信号转导通路中的Ras复合体途径(RasRafERKCREB)而抑 制胰岛素启动子活性，从而揭示HMGCoA还原酶抑制剂抑制胰岛素mRNA表 达的可能分子机制。图1胰岛素信号转导示意简图乙酰CoAHMGCoA甲羟戊酸J甲羟戊酸PP二甲基内烯焦磷酸酯(DMAPP)逦一Farnasylated Proteinsz叫(Ras)+一焦磷酸法呢酯(FPP)GeranylgeranyIatedProteins+一 焦磷酸龙牛儿基龙牛(Rho，Rac)儿醇(GGPP)图2甲羟戊酸(MVA)代谢图4天津医科大学硕士学位论文研究目的、方法为了检测他汀类药物是否会通过抑制对Ras蛋白的翻译后修饰，

41、抑制 RasGTPase活性，进而抑制胰岛13细胞内胰岛素信号转导通路中Ras复合体信 号转导途径(Ras瓜a忱砌CREB)而抑制核转录因子CREB与CRE结合，最 终抑制胰岛素启动子活性，从而揭示HMGCoA还原酶抑制剂抑制胰岛素 mRNA表达的可能分子机制，完善该类药物影响胰岛B细胞功能及糖代谢的理论，结果将为临床合理用药提供理论参考。我们在实验中，通过Western blot、 RT-PCR等逐一检测了Ras复合体信号转导途径(Ras瓜a纯R列CREB)各个关 键激酶活性的变化，同时设立了Ras GTPase活性抑制剂作为佐证。通过染色质免疫共沉淀法检测了HMGCoA还原酶抑制剂对胰岛B

42、细胞株INS1细胞核 转录因子CREB与CRE结合影响。我们以胰岛p细胞株INS1细胞为研究对象，将培养的INS一1细胞分组： (1)对照组(Contr01)：加入含56mmolL的葡萄糖的培养液；(2)高糖组(HG)： 加入含25 mmolL葡萄糖的培养液；(3)g7托伐他汀(Atorvastatin)处理组：按 照浓度梯度分为四组，a：加入含25 mmolL葡萄糖和1tmolL阿托伐他汀的 培养液处理细胞；b：加入含25 mmolL葡萄糖和10pmolL阿托伐他汀的培 养液处理细胞；c：加入含25 mmolL葡萄糖和50tmolL阿托伐他汀的培养液 处理细胞；d：加入含25 mmolL葡萄

43、糖和1001amolL阿托伐他汀的培养液处 理细胞；(4)Ras GTPase抑制剂(Manumycin A)处理组：将配好的Manumycin A储存液，放入含胎牛血清(浓度为10)、25 mmolL葡萄糖的RPMI一1640培养液中稀释成5pmolL处理细胞。 待细胞生长状况良好，细胞生长至90左右密度后，同步化24小时，分别用以上各因素处理细胞并继续培养，于培养24小时后收集细胞。提取总mRNA， 逆转录成cDNA，采用实时荧光定量PCR法检测各组INS一1细胞Ras的mRNA 表达：分别提取细胞成分蛋白，即细胞膜、浆、核蛋白，应用Westemblot法 检测体外胰岛13细胞Ras GT

44、Pase、Ras、磷酸化Raf-1激酶(pRaf-1)、总Raf-1 激酶、CREB、磷酸化CREB(pCREB)蛋白表达情况；染色质免疫共沉淀法检 测该类药物对INS1细胞p-CREBDNA结合活性的影响。5天津医科大学硕士学位论文材料和方法1材料11实验对象 大鼠胰岛p细胞株，细胞号为：INS1，由天津医科大学基础医学研究中心提供。 12主要实验试剂与仪器试剂与仪器名称生产厂家荧光倒置相差显微镜日本Olympus公司多功能酶标仪瑞士TECAN公司电热恒温干燥箱天津争光真空仪器厂超净工作台苏州净化设备有限公司实时荧光定量PCR仪LightCycleRoche公司Western blot实验仪

45、器美国Biorad公司凝胶成像分析系统美国BD公司微量移液器德国Eppendorf公司Suprafuge22高速冷冻离心机德国Heraeus公司M2300型二氧化碳培养箱美国Sheldon公司阿托伐他汀(ATO)美国辉瑞公司Manumycin A美国Sigma公司RPMI一1 640培养基北京天润善达生物科技公司二甲基亚砜(DMSO)(分析纯)天津化学试剂科贸公司一抗抗体美国Bioworld公司DNA Marker北京赛百盛生物工程公司逆转录酶天根生化科技有限公司产品 TRIzol、SYBRPremix Ex TaqTM大连宝生物工程有限公司产品； 试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTP辣根过

46、氧化物酶标记的山羊抗兔武汉博士德生物公司IgGp-CREB(Serl 33)抗体美国Santa Cruz公司6天津医科大学硕士学位论文13有关试剂的配制131 DHanks液的配制成分含量(单位：g)KCL040NaCL800KH2P04O06NaHC01035Na2HP0412H200135酚红001将上述各组分依次加入750ml超纯水中完全溶解，加超纯水定容至1000ml，用1M NaOH或1M HCL调PH值至72，高压灭菌，4。C保存。132025细胞消化液的配制 称取0259胰蛋白酶粉末于烧杯中，加入DHanks液将胰酶调成糊状，补足容量至1 00ml，混匀，用NaHC03粉末调整P

47、H值为80，滤纸粗滤后用0229m的一次性滤器过滤除菌，4。C保存。133PBS液(O01molL)的配制成分含量(单位：g)NaCl80KClO2Na2HP04115KH2P0402800ml双蒸水溶解，调pH至72，定容至1000ml，分装，高压灭菌，4。C保存。134单去污剂裂解液(PMSF)成分含量1 molL TrisHCl(pH80)25mlNaCl04389TritonX1 OO05ml蒸馏水至50ml混匀后4。C保存。7天津医科大学硕士学位论文二二二_二_一一135还原型5XSDS上样缓冲液成分含量10 molL Tris。HCl(pH68)125ml二硫叔糖醇(DTT，MWl

48、 545)0399SDS059溴酚蓝0025 甘油25ml混匀后，分装于15ml离心管中，4保存。 136电泳液缓冲液成分含量Tris(MWl2114)3039甘氨酸(MW7507)18779SDS102去离子水以去离子水定容至1000m1 溶解后室温保存，次溶液可重复使m35次。137转移缓冲液成分含量甘氨酸(MW7507)299Tris(MWl2114)589SDS0379甲醇200ml去离子水以去离子水定容至1 000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用3-5次，最好保存在4冰箱。138封闭液(5)成分含量(单位：g)脱脂奶粉59TBST100m18天津医科大学硕士学位论文139 50&

49、#215;Tris乙酸(TAE)电泳缓冲液成分含量Tris碱2429冰乙酸571ml05molL EDTA(PH 80、)1 00ml加蒸馏水补至1000ml，室温保存。1310O1DEPC水配制将lml DEPC)Jfl入1000ml双蒸水中，充分混匀过夜，高压灭菌，4。C保存备用。l-311CHIP实验所需溶液FA Lysis Buffer(1 OOml)成分含量250mmolL HEPES-KOH(pH75)20ml2 molL NaCl7 ml500 mmolL EDTA(pH80)200ul100Triton X100lml1Sodium Deoxycholate1 0ml 10SD

50、Slml1 00 X Protease Inhibitors stock solution1 ml加蒸馏水补至100ml。RIPA Buffer(1 OOml)成分含量1 mmolL Tris-HCI(pH8O)5ml 2molL NaCl75ml500 mmolL EDTA(pH80)400ul NP4010m11Sodium Deoxycholme50ml 10SDS1ml1 OO X Protease Inhibitors stock solution1ml加蒸馏水补至100ml。9天津医科大学硕士学位论文Wash Buffer(200m1)成分含量10SDS2mlTriton X100

51、2ml500 mmolL EDTA(pH8O)800ul 2 molLNaCl1 5ml1 mmolL TrisHCl(pH80)4m1去离子水以去离子水定容至200mlFinal Wash Buffer(100m1)成分含量10SDS1m1Triton X1001ml500 mmolL EDTA(pH80)400ul2 molLNaCl25ml1 mmolL Tris-HCI(pH8O)2ml去离子水以去离子水定容至100mlElution Buffer(50m1)成分含量10SDS5ml500 mmolL NaHC031 Oml去离子水以去离子水定容至50ml10天津医科大学硕士学位论文2

52、实验方法21大鼠胰岛p细胞株INS1细胞培养2。11细胞复苏 从液氮罐中取出冻存管，在37恒温水浴箱中摇晃冻存管，迅速解冻细胞，酒精擦拭冻存管后，按照无菌原则放入超净工作台，打开冻存管。用吸管吸出 细胞悬液加入已加有35mL培养基的离心管中，1000rm离心5分钟，倒掉上 清液，加入10ml完全培养基(含10胎牛血清，509molL13巯基乙醇，100uml青霉素和100uml链霉素的RPMI1640培养基)，吹打离心管壁使其成细胞悬液，吸出，接种于10CM培养皿中，显微镜下观察可见大量圆形细胞，放入37。C、 5C02、饱和湿度的细胞培养箱内培养。212细胞传代 倒置显微镜下观察细胞生长情况呈70。80的混合状态生长、细胞达致密单层时即可传代。弃去旧培养液，加入DHanks液冲洗一次，培养皿中加入适 量消化液，37消化约23分钟，显微镜下观察细胞失去原有形态，皱缩成圆 形或不规则形，细