镉重金属对野生稻与栽培稻杂交选育后代种子萌发

1、 前言实验设计的思路是参照水稻_OryzasativaL_省略_的重金属毒害与耐性的分子机理研究_葛才林博士论文的研究框架与结果，如下图所示。实验选择测定的物质有：糖类代谢： 淀粉酶活性与同工酶测定、苹果酸脱氢酶、细胞色素氧化同工酶分析、甘露聚糖酶、蔗糖酶活性检测。蛋白质代谢：谷胱甘肽含量测定、蛋白酶活性测定、镉诱导蛋白合成分析。脂类代谢：丙二醛测定、酯酶测定分析、脂氧合酶同工酶分析。抗氧酶检测：POD过氧化物酶、SOD超氧物歧化酶、同工酶检测。镉重金属对野生稻与栽培稻杂交选育后代种子萌发、幼苗形态 建立的生理影响研究实验设计从基础物质代谢（糖类代谢、蛋白代谢、脂类代谢）、抗氧化机制两大方面进

2、行实验设计。1、 基础物质代谢 1、糖类代谢 （1）水稻主要储藏物质代谢：淀粉 淀粉酶活性与同工酶测定【1】 【实验结果文献参考】实验设计：淀粉酶活性的测定 一、原理 淀粉酶能将淀粉水解成麦芽糖，由于麦芽糖能将3，5-二硝基水杨酸试剂还原成3-氨基-5-硝基水杨酸的橙红色化合物，且在一定范围内还原糖的浓度与反应液的颜色成正比，故利用比色法可求出麦芽糖的含量。以5分钟内每克样品水解产生麦芽糖的毫克数表示酶活性的大小。 植物淀粉酶可分为-淀粉酶和-淀粉酶两种，其中-淀粉酶不耐热，在温度70以上易钝化：而-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。根据以上特性，可分别测

3、定这两种淀粉酶的活性。如测定-淀粉酶和-淀粉酶的活性，即为淀粉酶总活性。 二、实验材料、 仪器 及试剂 1 仪器 ： 20ml具塞试管 移液管 100ml容量瓶 石英砂 研钵 721型分光光度计 离心机 恒温水箱 离心管 2 试剂 ： （1）1%淀粉溶液：称1.0克可溶性淀粉，加入100ml蒸馏水煮沸。（临用时配制） （2）pH5.6柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸21.0克，溶解后定容至1000ml；B、称取柠檬酸钠29.4克，溶解后定容至1000ml；量取A液55ml与B液145ml混匀，即为pH5.6的缓冲液。 

4、（3）0.4mol/L氢氧化钠溶液。 （4）3,5-二硝基水杨酸 试剂 ：取1.0克3,5-二硝基水杨酸，溶于20ml mol/L氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖，勿使二氧化碳进入。 （5）麦芽糖标准溶液：称取0.1000克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，然后定容至100ml，取为1mg/ml麦芽糖标准液。实验材料：萌发水稻种子。 三、实验方法 1酶液的制备：称取去根萌发水稻种子2克（含外壳），置研钵中，加1克石英沙研磨成匀浆。用8ml蒸馏水分次洗涤研钵，将匀浆转入 离心管 中，搅拌均匀后放置

5、1520分钟（间隔搅拌23次）。3500rpm离心10分钟，将上清液转入100ml容量瓶，用蒸馏水定容至刻度，得粗酶液。 2淀粉酶与-淀粉酶的酶促反应： 取4支10ml具塞刻度 试管 ，编号，按下表加入各液：  将以上各管混匀后，置40水浴准确保温5分钟，取出后立即向3、4号 试管 中加入4ml 0.4mol/L NaOH终止酶活性。 3麦芽糖的测定： （1）标准曲线制作：取20ml 刻度试管7 支，编号，分别加入1mg/ml 麦芽糖标准液0，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.0ml，然后各管加蒸馏水，使体积均达2ml，再向

6、各管加3，5-二硝基水杨酸试剂2ml，置沸 水浴 中煮沸5分钟，取出后冷却，用蒸馏水稀释至20ml，摇匀后在520nm波长下用分光光度计比色，以光密度值为纵坐标，麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。 （2）样品的测定：取以上酶作用后的反应液及对照管中的溶液各2ml，分别放入20ml具塞刻度试管中，加入2ml3，5-二硝基水杨酸试剂，置沸 水浴 中准确煮沸5分钟，取出冷却，用 蒸馏 水稀释至20ml，摇匀在520nm波长下用分光光度计比色，记录OD值，从麦芽糖曲线中查出相应麦芽糖含量，进行结果计算。 四、结果计算  A为酶反应管中麦芽糖含量，即3，4号管中麦芽

7、糖毫克数的平均值。 A为对照管中麦芽糖含量，即1，2号管中麦芽糖毫克数的平均值。参考现代植物生理学实验指南淀粉酶同工酶检测【2】（2） 呼吸中的糖相关代谢：苹果酸脱氢酶 （3） 细胞色素氧化同工酶分析 （4）其他糖代谢检测 ：*参考现代植物生理学实验指南#甘露聚糖酶（参考植物激素对水稻种子萌发过程中_甘露聚糖酶活性的调控_任艳芳 2、 蛋白质代谢 （1）谷胱甘肽含量测定（2） 蛋白酶活性测定参考现代植物生理学实验指南1999 p149(3） 镉诱导蛋白合成分析3、脂类代谢（1）脂膜氧化：丙二醛测定*实验方法参考现代植物生理实验指南1999 p305 (2) 酯酶测定分析：参考现代植物

8、生理实验指南#脂氧合酶同工酶（参考水稻种子成熟和萌发过程中脂氧合酶同工酶活性及其表达水平_汪仁）2、 抗氧机制 1、POD过氧化物酶、SOD超氧物歧化酶、同工酶检测 【实验原理】SOD是含金属辅基的酶，它催化以下反应： 0 2 - +0 2 - + 2H +   H 2 0 2 +0 2 由于超氧阴离子自由基0 2 - 寿命短，不稳定，不易直接测定SOD活性,而采用间接的方法。目前常用的方法有3种

9、, 包括氮蓝四唑(NBT)光化还原法，邻苯三酚自氧化法，化学发光法。本实验主要介绍光化还原法，其原理是：氮蓝四唑在蛋氨酸和核黄素存在条件下，照光后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙，蓝色甲腙在560nm处有最大光吸收.。SOD能抑制NBT的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。 试剂:1.50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液(PBS) 。含0.1m mol/l EDTA 2.220m mol/l甲硫氨酸：称3.2824g甲硫氨酸,用50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液定溶至100ml（现配现用）。 3.1.25m mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NB

10、T）溶液（现配）：称NBT 0.102g,用 50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液(PBS)溶解定容至100ml.  4.0.033m mol/l核黄素：称2.52mg 用PBS溶解定容至200ml（遮光保存）。【实验步骤】1酶液制备称取植物组织0.5g先加入2.5ml PBS，研磨匀浆后，再加入2.5ml PBS混匀，4下 10000r/min离心15min 上清液即为粗酶液。取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。2.酶活性测定取10ml小烧杯7只, 3只测定样品,4只作为对照，按下表加入试计:   试剂用量(ml

11、 )终浓度(比色时)50m mol/l   (PBS)220m mol/l   Met1.25m mol/l NBT0.033m mol/l核黄素酶液总体积        4.05         0.30.3         0.3     0.055.0 13m m

12、ol/l75µ mol/l2.0µ mol/l对照以缓冲液代替酶液  将上述试剂混匀后，1只对照烧杯至于暗处，另3只对照烧杯和样品一起置于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光一致，温度高时时间缩短，温度低时可适当延长）。最后在560nm处测定反应液的光密度。以不照光的对照烧杯作参比，分别测定其他各管的光密度。3.蛋白含量的测定步骤1的上清液经适当稀释后用考马斯亮蓝 G-250法测定蛋白含量.【实验结果及计算】 SOD活性单位是以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。可按下式计 算SOD活性： SOD总活

13、性=   SOD比活力=SOD总活性/蛋白质总浓度      式中: SOD总活性以 U/gFW,比活力单位以 U/mg蛋白表示 ACK为对照杯(光照)的光吸收值;AE为样品的光吸收值;V为样液总体积,V1为测定时样品用量,W为样重g.过氧化物酶(POD)活性的测定 【实验原理】植物体内的黄素氧化酶类代谢产物常包含H 2 0 2 ，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中 的葡萄糖氧化酶等。H 2 0 2 的积

14、累可导致破坏性的氧化作用。过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)是清除 H 2 0 2 的重要保护酶，能将H 2 0 2 分解为0 2 和H 2 0, 从而使机体免受H 2 0 2 的毒害作用。其活性与植物的抗逆性密切相关。(CAT)催化如下反应：              

15、       2 H 2 0 2 →2 H 2 0 + 0 2本实验通过测定H 2 0 2 的减少量来测定CAT的活性。在H 2 0 2 存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚。可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。【试剂药品1.50m mol/l pH7.0的磷酸缓冲液2.0.3% H 2 0&#

16、160;2: 吸0.5ml 30% H 2 0 2 加入pH7.0的磷酸缓冲液至 50ml3.0.2% 愈创木酚 :秤0.2g愈创木酚加入pH7.0的磷酸缓冲液至 100ml【实验步骤】 酶液的制备 1.称取叶片 0.25g ，加入5倍量的（M/V）pH7.0 的PBS 冰浴研磨 15000r/min 离心15min取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。 2. CAT 活性的测定在3ml的反应体系中，包括0.3% H 2 0 2  1ml, H 2 0 1.95ml, 最后加入0.05ml酶液启动反应，测定波长240nm处的OD降低速度。将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。