高效液相色谱仪的操作使用

1、 1 液相色谱流动相的选择与配制一高效液相色谱仪的操作步骤三 食品营养与检测专业教学资源库 目录页高效液相色谱仪的操作流程二 1 食品营养与检测专业教学资源库 一、液相色谱流动相的选择与配制 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂、载液，它对待测样品具有亲和力。正确选择流动相直接影响待测样品组分的分离度。 1、液相色谱流动相的选择 2、液相色谱流动相的配制 3、等度洗脱和梯度洗脱高效液相色谱仪的使用 （6 4 食品营养与检测专业教学资源库 （一）液相色谱流动相的选择 （1）化学稳定性好。不与样品组分发生化学反应，不能溶解固定相，也不改变固定相的特性。 （2）对样品有合适的溶解度和良好的选择性。

2、 （3）与检测器相匹配。对于紫外吸收检测器，要求流动相在紫外区吸收很弱。采用示差折光检测器，要求与样品组分折射率有较大差别，以达最高灵敏度。 （4）低黏度。黏度高的溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效；还会增高柱压力，不利于分离。但黏度过低的溶剂也不宜采用，如戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离检测。 （5）低毒性。 （6 4 食品营养与检测专业教学资源库 （二）液相色谱流动相的配制1、溶剂选择 配制水系流动相要求使用超纯水（电阻率18M）。去离子水及双蒸水中含有有机杂质，吸光率较高，影响分析结果。 有机系流动相要求使用色谱纯（HPLC级）有机溶剂。 4 食品营养与检测专业

3、教学资源库 （二）液相色谱流动相的配制2、流动相的过滤 目的：为了防止不溶物堵塞流路或色谱柱入口处的微孔垫片。 严格地讲，流动相都应该采用特殊的流动相过滤器，用0.45m以下微孔滤膜进行过滤后才可使用。 滤膜分为：有机系滤膜、水系滤膜。流动相过滤装置 （6 4 食品营养与检测专业教学资源库 （二）液相色谱流动相的配制3、流动相的脱气 流动相在上机之前需经脱气，以除去溶解在流动相中的气体。 目的：使泵的输液更准确，提高保留时间和峰面积的重现性；提高检测器的性能，稳定基线，增加信噪比；保护色谱柱，防止填料氧化，减少死体积。 方法：超声波振荡脱气、惰性气体鼓泡吹扫脱气、在线（真空）脱气 （6 4 食

4、品营养与检测专业教学资源库 （1）超声波振荡脱气 设备：超声波清洗器 方法：将配制好的流动相连同容器一起放入超声水槽中，超声脱气10-20min即可。 特点：该法操作简便，又基本能满足日常分析的要求，因此，目前仍被广泛采用。 （6） 4 食品营养与检测专业教学资源库 （2）惰性气体（氦气）鼓泡吹扫脱气 方法和原理：将钢瓶中的氦气缓慢而均匀地通入贮液器里的流动相中，氦气分子将其他气体分子置换和顶替出去，流动相中只含有氦气。由于氦气本身在流动相中的溶解度很小，而微量氦气所形成的小气泡对检测没有影响，从而达到脱气的目的。 （6） 4 食品营养与检测专业教学资源库 （3）在线真空脱气 原理：将流动相通

5、过一段由多孔性合成树脂膜构成的输液管，该输液管外有真空容器。真空泵工作时，膜外侧被减压，相对分子质量小的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进入膜外而被排除。 优点：可同时对多个流动相溶剂进行脱气。在线真空脱气装置原理图 （6 4 食品营养与检测专业教学资源库 （二）液相色谱流动相的配制4、流动相的贮存 贮存容器：流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存于塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出兼表面的增塑剂，导致溶剂受污染。 缓冲盐类流动相存放时间长易长霉，应现配现用，或置4以下冰箱保存（3天内使用），用前应重新过滤。 （6 4 食品营养与检测专业教学资源库 （三）等度洗脱和

6、梯度洗脱1、等度洗脱 概念：是指在同一分析周期内流动相组成保持恒定。 应用：适用于组分数目少，性质差别不大的样品分析。2、梯度洗脱 概念：是指在一个分析周期内程序地改变流动相的组成，即程序地改变流动相的极性、离子强度等。 目的：改进复杂样品的分离效果；改善峰形，减少拖尾并缩短分析时间；降低最小检测量和提高分离精度。 应用：用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。 1 食品营养与检测专业教学资源库 二、高效液相色谱仪的操作流程开机前的准备开机建立分析方法冲洗系统样品分析平衡系统关机数据处理高效液相色谱仪的使用 2 食品营养与检测专业教学资源库 （一）开机前的准备（二）开机操作（三）建立分析方

7、法，平衡系统（四）样品分析（五）冲洗系统，关机（六）数据处理三、高效液相色谱仪的操作步骤高效液相色谱仪的使用 1 食品营养与检测专业教学资源库 （一）开机前的准备工作 1、了解仪器的主要性能参数，熟悉仪器操作规程。 2、根据所分析样品的特点确定使用的色谱柱、检测器和流动相及其他分析条件。 3、准备流动相和待测样品。 4、安装色谱柱。 5、检查并连接好电路。高效液相色谱仪的使用 1 食品营养与检测专业教学资源库 （二）开机操作 1、打开高效液相色谱仪各模块的电源开关，仪器将进入自检状态。自检完成后仪器相应模块上会给出指示。 2、开启电脑，进入色谱工作站，进行联机。高效液相色谱仪的使用 1 食品营

8、养与检测专业教学资源库 （三）建立分析方法，平衡系统 1、进行系统配置。 2、编辑分析方法，包括： 仪器各项状态参数和工作参数的选择；分析与测定条件的设定；梯度洗脱时的洗脱梯度；进样方式；数据的采集、处理与输入方式、文件保存路径等。 3、保存分析方法并运行该方法，开始平衡系统。 4、至少使用20倍柱体积的流动相使色谱柱充分平衡，以获得稳定的基线。高效液相色谱仪的使用 1 食品营养与检测专业教学资源库 （四）样品分析 待仪器达到分析方法所设定的状态，且检测器输出的基线稳定后，可进样进行分析。 两种方式 ：单针进样、序列进样 单针进样：输入单次样品信息（样品名称、编号、进样体积、数据文件名称和存贮

9、路径等），运行单针进样程序。 序列进样：建立样品序列表，输入所有样品信息（样品瓶位置、样品名称、编号、进样体积、数据文件名称和存贮路径、方法文件等），运行批处理程序。高效液相色谱仪的使用 1 食品营养与检测专业教学资源库 （五）冲洗系统、关机 1、冲洗系统：分析结束后要用洗脱能力强的洗脱液冲洗进样阀、色谱柱、检测器，直至基线平直。当使用酸或碱缓冲溶液作为流动相时，应先用95%水-甲醇（或乙腈）冲洗系统（除去缓冲盐），再用100%甲醇（或乙腈）冲洗，保护柱子。 2、关机：将流速逐步下降至压力接近于0，在工作站中关闭系统，退出工作站操作软件，再关闭仪器电源开关，若仪器各个单元分别有电源开关时，依次关闭检测器、梯度洗脱装置、高压输液泵的电源。高效液相色谱仪的使用 1 食品营养与检测专业教学资源库 （六）数据处理 1