第四章离心技术

1、仪器分析曾曾 瑾瑾生命科学学院生命科学学院是将含有微小颗粒的悬浮液置于转头中，利用转头绕轴旋转所产生的离心力，将悬浮的微小颗粒按密度或质量的差异将其分离的方法。 通常把微粒等速沉降运动时的速度称为沉降速度，可写为：m(1-0/)g=f(dx/dt) 此式可见粒子的沉降速度与m(1-0/)成正比，与阻力系数f成反比。 二、相对离心力二、相对离心力 离心机所产生的离心场(G)，通常以如下方程式表示:G=2r 式中，为转头的角速度，以rads表示；r为旋转半径(物质质点所处位置与旋转中心的距离) 离 心 场 通 常 用 相 对 离 心 力 ( R e l a t i v eCentrifugal F

2、orce，RCF，用符号FRC表示)，也就是离心力的大小相当于地心引力(即重力加速度g)的倍数来表示，即FRC=(2r/g)g 公式进一步推导FRC=(2n)2r/602gg=1.11910-5n2rg 式中，n为转头转速，以转分(revolutions per minute，简写成rmin)表示；g为重力加速度，等于9806cms2 例如：在某个角度转头中，离心管口到旋转中心的距离为4.8cm，而离心管底到旋转中心的距离是8.0cm，当转速为12 000rmin时，离心管口和离心管底所受到的相对离心力FRC分别是： FRC(管口)=1.11910-5(12 000)24.8g =7 734g

3、 FRC(管底)=1.11910-5(12 000)28.0g =12 891g 三、沉降速度三、沉降速度 沉降速度(sedimentation velocity)：是指在强大的离心力作用下，单位时间内物质颗粒沿半径方向运动的距离。 被分离物质颗粒(或大分子)在离心管中与转头一同旋转时承受着沿半径方向的直接离心力作用，用Fc来表示，那么Fc=M2r 由于颗粒处在液体介质中，还必须考虑浮力的作用，因此我们用有效质量来表示被分离颗粒物质在离心场中质量的大小，即M=V(-m) 假定颗粒为球形，则 这样我们就得到公式 Fc=16D3 (-m) 2r 式中，M为颗粒有效质量，用克(g)表示为转头角速度，

4、用弧度秒(rads)表示r为旋转半径，用厘米(cm)表示和m分别为颗粒和介质的密度，用克厘米3(gcm3)表示V为颗粒体积，用立方厘米(cm3)表示D为颗粒的直径，用厘米(cm)表示 361DV 颗粒受Fc作用沿半径方向运动，即沉降，当颗粒以速度v(cms)沉降时，又受到摩擦力(Ff)的作用。Ff=fv 式中，f为摩擦系数， 与介质的粘度(m，单位帕秒、Pas)和颗粒的线性大小有一定关系，对一个球形颗粒来说，按照Stokes定律f=3mD 颗粒受Fc、Ff的合力作用向管底沉降。当Fc=Ff时，颗粒即达到其最终速度，并保持匀速运动。即16D3 (-m)2r=3mDv 移项整理得: v=（1/18

5、）D2 (-m) 2r/m 因为 =2n/60 所以 v=6.09210-4D2(-m)n2r/m 由此可以看出，颗粒沉降速度与三方面的因素有关： (1)(1)颗粒本身的性质颗粒本身的性质 沉降速度与颗粒直径和密度成正比。密度相同时大颗粒比小颗粒沉降快；大小相同时，密度大的颗粒比密度小的沉降快。 (2)(2)介质的性质介质的性质 沉降速度与介质的粘度、密度成反比，介质粘度、密度大，则颗粒沉降慢。 (3)(3)离心条件离心条件 颗粒沉降速度与离心时转速和旋转半径成正比。如果其他的条件不变，沉降速度随着r的增大而增大。四、沉降系数四、沉降系数(一一)沉降系数沉降系数沉降系数(sedimentati

6、on coefficient)是指单位离心场作用下颗粒沉降的速度，以s来表示，s=v(2r)。我们已经提到颗粒的沉降速度v与2r成正比。即 s=KD2 (-m)/m 假定颗粒为球形 K=1/18 从上式可看出：沉降系数s的值与颗粒的大小、形状和密度，以及离心所使用的介质的密度和粘度有关，而与转头的速度和类型无关。 (二二)沉降常数沉降常数 公认的标准介质是20的水，它的密度和粘度(20,w，20，w)是已知的。在这种标准介质中所确定的颗粒的沉降系数只依赖于颗粒本身的两个参数，即颗粒大小和密度，而这两个参数可以用离心的方法确定。颗粒在20水中的沉降系数称为其沉降常数S20 w。S20 w =KD

7、2 (-20w)/20w S20 w与它的测量状态无关，因而具有通用的特性。 确定沉降常数没有必要一定在水中进行离心。如果已知介质的特征值(Pm，m)，就可利用在该介质中离心的数据确定沉降系数s，再将S20 w的表达式除以s的表达式，即可求出颗粒的沉降常数。 S20 w/s= KD2 (-20w)/20w/ KD2 (-m)/m S20 w=sKD2 (-20w) m / (-m) 20w = v(2r)(-20w) m / (-m) 20w 由此看出，如果已知在一定角速度和旋转半径r时的沉降速度v以及颗粒的浮力密度及其所在介质的密度与粘度(、m)，就可以确定颗粒的沉降常数S20 w。，S20

8、 w的单位命名为Svedberg，以S表示：l S=10-13s(秒） (三三)沉降系数与物质相对分子质量沉降系数与物质相对分子质量 由沉降系数根据Svedberg公式可以计算出物质的相对分子质量：Mr=RTS20 w/D20 w(1- )式中，Mr是相对分子质量D20 w是以20的水为介质时颗粒的扩散系数T是绝对温度S20 w是颗粒的沉降常数为偏比容，等于溶质粒子密度的倒数R是摩尔气体常数，等于8.315J(molK)是溶剂密度 用此式计算物质的相对分子质量俗称SD法。也可用粘度()来求相对分子质量(俗称S法)：M=4 69812/(l-) 可以看出，无论是SD法还是S法，都必须在已知物质的

9、某些物理常数的前提下才能计算，由于物质结构的复杂性，求得的相对分子质量往往是近似值 五、沉降时间五、沉降时间 样品颗粒完全沉降到管底内壁的时间tm，可以下列方程式表示：tm=(1/S)(lnx2-lnx1)/ 2 式中，x2表示旋转中心到离心管底内壁的距离x1表示旋转中心到样品溶液弯月面之间的距离 s为样品沉降系数第二节第二节 离心机的构造离心机的构造 （离心机的构造图）（离心机的构造图） 一、离心室一、离心室（图）（图） 二、驱动系统二、驱动系统 三、冷冻系统三、冷冻系统 四、真空系统四、真空系统 五、操作系统五、操作系统第三节第三节 离心转头和离心管离心转头和离心管 一、角度转头一、角度转

10、头（图）（图） 二、甩平转头二、甩平转头（图）（图） 三、垂直转头三、垂直转头（图）（图） 四、区带转头四、区带转头 五、五、连续流动离心转头连续流动离心转头 六、其他转头六、其他转头 七、离心转头的常用标记及转头参数七、离心转头的常用标记及转头参数 1转头标记的意义转头标记的意义 (1)符号：角度转头FA，垂直转头V；甩平转头SW；连续转头CF；区带转头Z。 (2)英文字母后的数字表示该转头的最大额定转速。 (3)Ti表示由钛或钛合金为材料制成的转头，不标则为铝或铝合金做成的转头。 如：SW65Ti指该转头为甩平转头，最大额定转速为65 000 rmin，转头由钛金属制成。 2转头参数转头参

11、数 Rmax：从转轴中心至离心管最外缘或离心管底的距离； Rmin：从转轴中心至离心管最内缘或离心管顶的距离； RPMmax：转头的最高安全转速； FRCmax：转头以RPMmax运转时，在Rmax处的相对离心力； FRCmin：转头以RPMmax运转时，在Rmin处的相对离心力； K：衡量转头相对效率的量，K值愈小，效率愈高，所需离心时间就愈短八、离心管八、离心管 不同材料的离心管耐酸碱、抗腐蚀、抗温变性能不同，能承受的压力也不一样，在使用前必须依据样品溶剂的化学性质和离心转速选择合适的离心管。常用的塑料离心管有聚乙烯管(PE)、纤维素管(CAB)、聚碳酸酯管(PC)和丙二醇酯管(PP)等。

12、 第四节第四节 各型离心机的性能各型离心机的性能 及适用范围及适用范围 一、低速离心机一、低速离心机 二、高速离心机二、高速离心机 三、超速离心机三、超速离心机 第五节第五节 离心方法离心方法 一、差速沉淀离心一、差速沉淀离心（图）（图） 差速沉淀离心(differential centrifugation)系指分步改变离心速度，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分批沉淀分离的方法，它适用于沉降速度差别在一到几个数量级的混合样品的分离，对于差别较小的物质，差速离心难以得到满意的分离效果。 二、速度区带离心二、速度区带离心（图）（图） 速度区带离心(rate zonal centrifuga

13、tion)是将样品置于一个平缓的介质梯度中沉降，该梯度的最大密度低于样品混合物的最小密度，样品颗粒按照其不同的沉降速率沉降，从而互相分离。离心一定时间后不同大小的颗粒将沉降在不同的层次，产生所谓区带。由于这种方法是根据颗粒的沉降速率来完成分离，且离心过程中形成区带，所以称作速度区带离心。这种方法适用于分离密度相似而大小有别的样品。 (一一)介质密度梯度的特征和制备介质密度梯度的特征和制备 密度梯度的制备： 1、手工制备 先以不同浓度(密度)的梯度液(加蔗糖)，按由浓到稀的次序依次铺入离心，形成不连续阶梯密度。将此液柱的离心管垂直静置在试管架上，在室温2025时，只要23 h即会因重力作用及扩散

14、作用而形成连续近线性的密度梯度。 2、仪器法制备 直接用密度梯度形成收集仪制备梯度。 3、冷冻法制备 用浓度等于高、低平均值的蔗糖或其他梯度液，等量放人各离心管中，然后垂直放置在-20-40低温冰箱内冻结后取出，在室温下静置熔化，如此反复二次即成近直线型梯度分布。 (二二)速度区带离心介质的选择速度区带离心介质的选择 1蔗糖 2甘油 三、等密度离心三、等密度离心（图）（图） 等密度离心(isopycniccentrifugation)又叫做平衡离心(equilibrium centrifugation)。样品被置于一个较陡峭的密度梯度中沉降，该梯度的最大密度高于样品混合物的最大密度，梯度的最小

15、密度低于样品混合物的最小密度，当样品颗粒沿梯度运动到与颗粒的浮力密度相同的密度层时，就停止运动，这样经过一段较长时间的离心，样品中所有不同密度的颗粒就都将在各自的等密度区域中停止运动，从而分布在不同的密度梯度区域，即颗粒根据各自的浮力密度进行分级分离。由于这种离心是将样品颗粒沉降到介质中与其浮力密度相等的密度梯度区，故名之等密度离心或平衡离心。这种方法适用于分离大小相近而密度不同的样品。 这种分离有五个特点： (1)离心过程很长。 (2)不需粘性介质。 (3)颗粒的最终分布与其大小和质量无关。无论其初始迁移速率如何，在给定的梯度中颗粒位置只受其浮力密度的影响。 (4)到达平衡位置的颗粒，一方面

16、来源于比其浮力密度低的低密度区，一方面来源于高密度区。也就是说漂浮与沉降同时发生。所以在等密度离心中样品可以和整个梯度相混合。 (5)样品的装载容积比速度区带离心大，并且不会形成局部反向梯度。 (一一)介质密度梯度的特征和制备介质密度梯度的特征和制备 由以上等密度离心的基本过程可知，采用介质密度梯度的主要目的是形成一系列具有不同密度的区域，以使具有不同浮力密度的颗粒处于其等密度区而彼此分离。介质的密度沿旋转半径增加，接近管底处的密度高于样品的最大密度，液面部分的密度低于样品的最小密度，等密度离心的介质密度梯度一般通过离心的方法来制备，如高浓度盐溶液，在离心力作用下盐离子依次向管底沉降，形成从液

17、面到管底逐渐增加的密度梯度，同时溶质的扩散又会阻碍这种梯度的形成，经过足够时间离心后，两个过程可达到平衡，形成盐溶液密度梯度，并在某一固定转速下保持稳定。 (二二)等密度离心介质的选择等密度离心介质的选择 1高浓度盐溶液 CsCl密度梯度主要用于DNA的分级分离；也可利用沉淀作用对少量RNA进行纯化。三氯乙酸铯密度梯度能够对单、双链RNA进行分离；可使核糖核酸酶失活并且能将DNA和蛋白质与RNA分开，也可以从DNA和RNA中分离出DNARNA杂交体。三氯乙酸铷密度梯度用于分离变性DNA和天然DNA。 NaI密度梯度也广泛应用于各种天然和变性DNA的分离。KI密度梯度也可用于分离DNARNA杂交体。NaBr或KBr密度梯度较多地用于血浆脂蛋白的分离。 2Metrizamide密度梯度 四、分析性离心四、分析性离心 离心除了用于制备外，还可用于样品的定性定量分析。在离心机上装备光学系统，采用特殊的透光离心池，在离心过程中可以直接观察样品颗粒的沉降情况，以对样品进行定性定量分析。 五、离心操作要领五、离心操作要领 1精密地平衡离心管和它们的内容物是十分重要的。 2平衡后的一对离心管及其内容物(有时还可能包括离心管套筒)应对称放置，不能错位，不能装载单数的管子，以免因离心所产生的离心力不对称而损坏离心轴。 3当平衡的离心管