培养基及其制备技术-教学课件

1、子情境：培养基及其制备技术主要内容第一节 发酵培养基的选择第二节 发酵培养基的设计与优化第三节 发酵培养基的成分及来源第四节 淀粉水解糖的制备第五节 糖蜜原料第六节 石油代粮发酵的原料第七节 其他原料发酵第一节 发酵培养基的选择v发酵培养基：发酵培养基： 满足菌体的生长、促进产物的形成 要符合增产节约、因地制宜v 能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常关键的一环。 孢子培养基孢子培养基v孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这种培养基的要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起菌种发生变异。v 配制要求： 营养不要太丰富，否则不宜产孢

2、子。 所用无机盐的浓度要适量，不然也会孢子量和孢子颜色。 要注意培养基的pH和湿度。种子培养基种子培养基v 种子培养基是供是供微生物菌体的生长繁殖。为了在较短的时间内获得数量较多的强壮的种子细胞，种子培养基要求营养丰富、完全，氮源、维生素的比例应较高，所用的原料也应是易于被微生物菌体吸收利用。 v 配制要求： 营养比较丰富和完全，总浓度略稀薄； 成分接近于发酵培养基。发酵培养基发酵培养基v 发酵培养基是除需要维持微生物菌体的正常生长外，主要目的是合成预定的发酵产物，所以，发酵培养基碳源物质的含量往往要高于种子培养基。 v 发酵培养基还应考虑便于发酵操作以及不影响产物的提取分离和产品的质量。v

3、要求： 发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有合成产物所需的特定元素、前体和促进剂等； 考虑培养基用分批补料工艺。v对发酵培养基进行科学的设计，包括两个方面的内容： 是对发酵培养基的成分及原辅料材料的特性有较为详细的了解； 是在此基础上结合具体微生物和发酵产品的代谢特点及对培养基的成分进行合理的选择和优化。一、发酵培养基选择的依据一、发酵培养基选择的依据v根据微生物的特点选择培养基 细菌、酵母菌、霉菌、放线菌四类v根据不同用途选择培养基 液体培养基和固体培养基v根据生产实践和科学试验的不同要求选择v根据经济效益分析选择培养基 价廉、来源丰富、运输方便、就地取材、无毒 二、发

4、酵培养基成分选择的原则二、发酵培养基成分选择的原则v不同的微生物所需要的培养基成分是不同的，要确定一个合适的培养基，就需要了解生产根据不同生产菌种的培养条件、生物合成的代谢途径、代谢产物的化学性质等确定培养基。 1菌体的同化能力v 微生物来源和种类的不同，所能分泌的水解酶系。微生物来源和种类的不同，所能分泌的水解酶系。v 酵母菌只能利用简单的糖类酵母菌只能利用简单的糖类 ：中国酒曲中含有丰富的淀粉：中国酒曲中含有丰富的淀粉酶和糖化酶，国外利用麦芽含有丰富的淀粉水解酶类。酶和糖化酶，国外利用麦芽含有丰富的淀粉水解酶类。v 许多碳源和氮源都是复杂的有机大分子，如豆饼粉、黄豆许多碳源和氮源都是复杂的

5、有机大分子，如豆饼粉、黄豆饼粉等。饼粉等。1菌体的同化能力v 微生物利用氮源的能力因菌种、菌龄的不同而有差异。v 同一微生物处于生长不同阶段时，对氮源的利用能力不同，在生长早期容易利用易同化的铵盐和氨基氮，在生长中期则由于细胞的代谢酶系已经形成，则利用蛋白质的能力增强。因此在培养基中有机氮源和无机氮源应当混合使用。2代谢物的阻遏和诱导作用v 对于快速利用的碳源如葡萄糖来讲，当菌体利用葡萄糖时产生的分解代谢产物会阻遏或抑制某些产物合成所需酶系的形成或酶的活性，即发生“葡萄糖效应”。v 抗生素发酵生产时，考虑分批补料或连续补料的方式来解除。v 酶制剂生产，难被利用的碳源(如淀粉、糊精等)有利于产酶

6、，几乎都选用淀粉类原料作为碳源。 2代谢物的阻遏和诱导作用v 有些产物会受氮源的诱导与阻遏v 蛋白酶的生产受培养基中蛋白质或多肽的诱导，而受铵盐、硝酸盐、氨基氮的阻遏。这时在培养基氮源选取时应考虑以有机氮源(蛋白质类)为主。v 在选择和配制发酵培养基时，要注意快速利用的碳(氮)源和慢速利用的碳(氮)源的相互配合，发挥各自优势，避其所短。 3合适的碳氮比v 培养基中的碳氮的比例（培养基中的碳氮的比例（C/NC/N）在发酵工业中尤为重要。）在发酵工业中尤为重要。v 氮源过多，则菌体繁殖旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量。v 碳源过多，则容易形成较低的pH；

7、碳源不足，菌体衰老和自溶。v 碳氮比不当还会影响菌体按比例吸收营养物质，直接影响菌体生长和产物的形成，菌体在不同生长阶段，对其碳氮比的最适要求也不一样。 3合适的碳氮比v 酵母细胞中碳氮比约为100：20，v 霉菌约为100：10。v 一般发酵工业中碳氮比约为l00：（0.2-2.0) 。v 氨基酸发酵中，因为产物中含有氮，所以碳氮比就相对高一些。如谷氨酸发酵的C：N为100：(1521)，若碳氮比为100：(0.22.0)，则会出现只长菌体，几乎不产谷氨酸的现象。 v理论+经验 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分； 通过单因子实验最终确定出最为适宜的

8、培养基成分； 采用合理的实验设计方法优化配方。 正交实验设计，方差分析 响应面法设计及分析单因子实验v碳源的选择v氮源的选择v诱导剂及前体的选择v无机盐的选择 对于单因素或两因素试验，因其因素少对于单因素或两因素试验，因其因素少 ，试验的设，试验的设计计 、实施与分析都比较简单、实施与分析都比较简单 。但在实际工作中。但在实际工作中 ，常，常常需要同时考察常需要同时考察 3个或个或3个以上的试验因素个以上的试验因素 ，若进行，若进行全面试验全面试验 ，则，则试验的规模将很大试验的规模将很大 ，往往因试验条件，往往因试验条件的限制而难于实施的限制而难于实施 。正交试验设计就是安排多因素正交试验设

9、计就是安排多因素试验试验 、寻求最优水平组合、寻求最优水平组合 的一种高效率试验设计方的一种高效率试验设计方法。法。 v 例如，要考察增稠剂用量、例如，要考察增稠剂用量、pH值和杀菌温度值和杀菌温度对豆奶稳定性的影响。每个因素设置对豆奶稳定性的影响。每个因素设置3个水平进行个水平进行试验试验 。v A因素是增稠剂用量，设因素是增稠剂用量，设A1、A2、A3 3个水个水平；平；B因素是因素是pH值，设值，设B1、B2、B3 3个水平；个水平；C因素为杀菌温度，设因素为杀菌温度，设C1、C2、C3 3个水平。这是个水平。这是一个一个3因素因素3水平的试验，各因素的水平之间全部水平的试验，各因素的水

10、平之间全部可能组合有可能组合有?种种 。v 3 3因素因素3 3水平的全面试验水平组合数为水平的全面试验水平组合数为3 33 3=27=27，4 4因素因素3 3水水平的全面试验水平组合数为平的全面试验水平组合数为3 34 4=81 =81 ，5 5因素因素3 3水平的全面试水平的全面试验水平组合数为验水平组合数为3 35 5=243=243，这在科学试验中是有可能做不到，这在科学试验中是有可能做不到的。的。 v(1)A1B1C1 (2)A2B1C2 (3)A3B1C3v(4)A1B2C2 (5)A2B2C3 (6)A3B2C1v(7)A1B3C3 (8)A2B3C1 (9)A3B3C2A3A

11、2A1B3C3v1.1 正交试验设计的基本概念正交试验设计的基本概念 v 正交试验设计是利用正交表来安排与分析多因正交试验设计是利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法。它是由试验因素的全部水素试验的一种设计方法。它是由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验的，通过对这部分试验结果的分析了解全面试验的的，通过对这部分试验结果的分析了解全面试验的情况，找出最优的水平组合。情况，找出最优的水平组合。v 这这9个试验点在选优区中分布是均衡的，在立个试验点在选优区中分布是均衡的，在立方体的每个平面上方体的每个平面上 ，都恰是，都恰

12、是3个试验点；在立方个试验点；在立方体的每条线上也恰有一个试验点。体的每条线上也恰有一个试验点。v 9个试验点均衡地分布于整个立方体内，有很个试验点均衡地分布于整个立方体内，有很强的代表性，强的代表性， 能够比较全面地反映选优区内的基能够比较全面地反映选优区内的基本情况。本情况。 v正交表正交表 v 由于正交设计安排试验和分析试验结果都要用由于正交设计安排试验和分析试验结果都要用正交表，因此，我们先对正交表作一介绍。正交表，因此，我们先对正交表作一介绍。v 其中其中“L”代表正交表；代表正交表；L右下角的数字右下角的数字“8”表示有表示有8行行 ，用这张正交表安排试验包含，用这张正交表安排试验

13、包含8个处理个处理(水平组水平组合合) ；括号内的底数；括号内的底数“2” 表示因素的水平数，括号内表示因素的水平数，括号内2的指数的指数“7”表示有表示有7列列 ，用这张正交表最多可，用这张正交表最多可以安排以安排7个个2水平因素。水平因素。L L9 9(3(34 4) )正交表正交表表表16 4直直 观观 分分 析析 计计 算算 表表 表 头 设 计 A B C 实 验 号 列 号 1 2 3 4 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 T1 555

14、485 555 D v 根据专业知识、以往的研究结论和经验，从影响试验指标根据专业知识、以往的研究结论和经验，从影响试验指标的诸多因素中，通过因果分析筛选出需要考察的试验因素。的诸多因素中，通过因果分析筛选出需要考察的试验因素。一一般确定试验因素时，应以对试验指标影响大的因素、尚未考察般确定试验因素时，应以对试验指标影响大的因素、尚未考察过的因素、尚未完全掌握其规律的因素为先。过的因素、尚未完全掌握其规律的因素为先。v 试验因素选定后，根据所掌握的信息资料和相关知识，试验因素选定后，根据所掌握的信息资料和相关知识，确定每个因素的水平，一般以确定每个因素的水平，一般以2-42-4个水平为宜。个水

15、平为宜。对主要考察的对主要考察的试验因素，可以多取水平，但不宜过多（试验因素，可以多取水平，但不宜过多（6 6），否则试验次），否则试验次数骤增。数骤增。因素的水平间距，应根据专业知识和已有的资料，尽因素的水平间距，应根据专业知识和已有的资料，尽可能把水平值取在理想区域。可能把水平值取在理想区域。水平水平试验因素试验因素加水量加水量（mL/100g）A加酶量加酶量（mL/100g）B酶解温度酶解温度（）C酶解时间酶解时间（h）D1101201.52504352.53907503.5试验号试验号因素因素液化率液化率A AB BC CD D1 11 11 11 11 10 02 21 12 22

16、22 217173 31 13 33 33 324244 42 21 12 23 312125 52 22 23 31 147476 62 23 31 12 228287 73 31 13 32 21 18 83 32 21 13 318189 93 33 32 21 14242试验号试验号因素因素液化率液化率A AB BC CD D1 11 11 11 11 10 02 21 12 22 22 217173 31 13 33 33 324244 42 21 12 23 312125 52 22 23 31 147476 62 23 31 12 228287 73 31 13 32 21 18

17、 83 32 21 13 318189 93 33 32 21 14242试验号试验号因素因素液化率液化率A AB BC CD D1 11 11 11 11 10 02 21 12 22 22 217173 31 13 33 33 324244 42 21 12 23 312125 52 22 23 31 147476 62 23 31 12 228287 73 31 13 32 21 18 83 32 21 13 318189 93 33 32 21 14242K14141131346468989K28787828271714646K36161949472725454k113.713.74.

18、34.315.315.329.729.7k229.029.027.327.323.723.715.315.3k320.320.331.331.324.024.018.018.0极差极差R15.315.327.027.08.78.714.314.3主次顺序主次顺序BADC优水平优水平A2B3C3D1优组合优组合A2B3C3D1加酶加酶加水加水温度温度时间时间第三节第三节 发酵培养基的成分及来源发酵培养基的成分及来源1、工业常用的碳源、工业常用的碳源葡萄糖、糖蜜、淀粉、糊精、油和脂肪、有机酸。葡萄糖、糖蜜、淀粉、糊精、油和脂肪、有机酸。2、工业常用的氮源、工业常用的氮源有机氮源、无机氮源有机氮源、

19、无机氮源生理酸碱性物质：无机氮源经微生物生理作用生理酸碱性物质：无机氮源经微生物生理作用（代谢）后能形成酸碱性物质（代谢）后能形成酸碱性物质3、 无机盐及微量元素无机盐及微量元素低浓度对微生物生长和产物合成有促进作用，低浓度对微生物生长和产物合成有促进作用，在高浓度时常表现出明显的抑制作用。在高浓度时常表现出明显的抑制作用。生产中要通过试验预先了解菌种对无机盐和微量元素的生产中要通过试验预先了解菌种对无机盐和微量元素的最适需求量，以稳定或提高产量。最适需求量，以稳定或提高产量。 4、生长因子、前体物质、产物抑制剂和促进剂、生长因子、前体物质、产物抑制剂和促进剂发酵培养基中某些成分的加入有助于调

20、节产物的形成，发酵培养基中某些成分的加入有助于调节产物的形成，而并不促进微生物的生长，而并不促进微生物的生长，一、碳源一、碳源1、作用、作用提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分的碳成分 提供合成目的产物所必须的碳成分提供合成目的产物所必须的碳成分2、来源、来源糖类、油脂、有机酸、正烷烃糖类、油脂、有机酸、正烷烃3、工业上常用的糖类、工业上常用的糖类 葡萄糖葡萄糖 所有的微生物都能利用葡萄糖所有的微生物都能利用葡萄糖 但是会引起葡萄糖效应但是会引起葡萄糖效应q 工业上常用淀粉水解糖工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的

21、质但是糖液必须达到一定的质 量指标量指标不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大 糖蜜糖蜜糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。 糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。一般糖蜜分。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响糖蜜使用的注意点：糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。

22、多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵例：谷氨酸发酵有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制）生物素（发酵控制）预处理：澄清预处理：澄清脱钙脱钙脱除生物素脱除生物素例：柠檬酸发酵例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）预处理：预处理：黄血盐黄血盐 淀粉、糊精淀粉、糊精使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点：难利用、缺点：难利用、 发酵液比较稠、发酵液比较稠、一般一般2.0%时加入一定的时

23、加入一定的-淀粉酶淀粉酶 成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格底优点：来源广泛、价格底 难利用，可以解除葡萄糖效应难利用，可以解除葡萄糖效应例：地衣牙孢杆菌生产例：地衣牙孢杆菌生产-淀粉酶淀粉酶碳源对生长和产酶的影响碳源对生长和产酶的影响碳源碳源 细胞量细胞量 -淀粉酶淀粉酶葡萄糖葡萄糖 4.2 0 蔗糖蔗糖 4.02 0糊精糊精 3.06 38.2淀粉淀粉 3.09 40.2李江华，无锡轻工大学学报，2004(1.5g麸皮)嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响结果：各种碳源相差不大推论：该菌种的碱性纤维素酶为组

24、成型苏勤，林业化学与工业，2004二、氮源二、氮源 氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。氮源和无机氮源。 1、无机氮源、无机氮源种类种类：氨盐、硝酸盐和氨水：氨盐、硝酸盐和氨水特点特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变的变化如：化如： (NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3

25、 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH 无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫性物质的无机氮源叫生理酸性物质生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质生理碱性物质，如，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的的pH有积极作用。有积极作用。 所以

26、选择合适的无机氮源有两层意义：所以选择合适的无机氮源有两层意义： q 满足菌体生长满足菌体生长q 稳定和调节发酵过程中的稳定和调节发酵过程中的pH毛霉产蛋白酶的研究陈涛，中国酿造，2004初始pH的影响:pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大无机氮源的影响：硫酸铵硝酸铵硝酸钠尿素2、有机氮源、有机氮源来源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼花生饼 粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋 白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒 糟糟。成分

27、复杂成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。盐及生长因子。例例 玉米浆：玉米浆： 可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 较多的乳酸较多的乳酸 硫、磷、微量元素等硫、磷、微量元素等 有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响氮源使用的一些相关问题：q 有机氮源和无机氮源应当混合使用有机氮源和无机氮源应当混合使用早期：容易利用易同化的氮源早期：容易利用易同化的氮源无机氮源无机氮源

28、中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质q 有些产物会受氮源的诱导和阻遏有些产物会受氮源的诱导和阻遏例：例： 蛋白酶的生产蛋白酶的生产q 有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力q 开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣 的课题的课题三、无机盐的微量元素三、无机盐的微量元素1、作用：各种不一样、作用：各种不一样2、来源：来源：C、N源，以盐的形式补充源，以盐的形式补充3、用量：根据具体的产品，以实验决定用量：根据具体的产品，以实验决定4、使用注意点使用注意点A. 对

29、于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑微量元素在发酵过程中必须加以考虑例：铁离子例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml 发酵罐必须进行表面处理发酵罐必须进行表面处理B、使用时注意盐的形式（、使用时注意盐的形式（pH的变化）的变化）例例：黑曲酶黑曲酶NRRL-330,生产生产-淀粉酶，淀粉酶，P对酶活的影响对酶活的影响 pH 酶活酶活不加不加 4.25 120分钟分钟加加 K2HPO4 5.45 30分钟分钟加加 KH2PO4 4.62 75分钟分钟四、生长因子、前

30、体和产物促进剂四、生长因子、前体和产物促进剂 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。 1、生长因子、生长因子 如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以型，以生物素生物素为生长因子为生长因子, ,生长因子对发酵的调控起到重生长因子对发酵的调控起到重要的作用要的作用 。 有机氮源有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子缺少的生长因子 前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。的提高。2、前体、前体青霉素：分子量青霉素：分子量356苯乙酸苯乙酸:分