微生物工业菌种与培养基

1、微生物工业菌种与培养基菌种与种子扩大培养菌种：实现从原料目的产物的关键生产效率、产品成本、产品质量 从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点； 诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证； 基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品开 发的进程。 从自然界中分离菌种的一般过程采样 预处理 培养 菌落的选择 产品的鉴定 选择育种方法时综合考虑的因素(1) 待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(2) 对这一特定菌种的遗传生化的认识程度(3) 经济费用 如，对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术； 如，对其遗传

2、及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。 一些常用工业微生物 抗生素生产有关的微生物 放线菌（链霉素 真菌（青霉素、头孢等）四环素；红霉素等） 一些产芽孢的细菌 植物或动物来源 氨基酸生产有关的微生物 氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单； 谷氨酸发酵的菌种：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌； 其它氨基酸生产菌：常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌。 食品工业微生物包括：酿造业，酶制剂等 食品用的微生物需经过严格的毒理试验，目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉

3、、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌。2、 工业微生物(菌种)的要求1）能在廉价原料制成的培养基上迅速生长和大量合成目的产物 -价值高2）能在要求不高、易控制的培养条件下迅速生长和发酵，发酵周期短。 -可操作性强3）根据代谢调控要求选择高产菌株，如营养缺陷型菌株或调节突变型菌株4）菌种抗噬菌体能力强，以防止感染噬菌体而造成“倒罐”现象的发生。5）菌种纯粹，不易退化，可保证发酵生产和产品质量的稳定性。 -遗传稳定性强6）菌种非病原菌，不产生任何有害的物质和毒素，以保证产品的安全。 -安全性强3、工业微生物菌种保藏技术（1）斜面保藏：3-6个月；（2）沙土管干燥保藏：2年；（3）液氮保藏：2-3年

4、；（4）悬液保藏：常温或低温；（5）超低温保藏：1年以上；（6）冷冻干燥保藏：5-10年。 菌种保藏目的：保证菌种在长时间内尽可能保持原有菌株优良的生产性能。基本原理：根据菌种的生理生化特点，创造条件使菌种的代谢活动处于不活泼的状态。基本原则：选用优良纯种和创造一个最有利于菌种休眠的环境。休眠环境：微生物生长繁殖和代谢受抑，不易突变的环境，一般要求低温、缺氧、缺营养、添加保护剂、干燥等。保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便保藏后需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)。 方 法 温度 保护剂 保藏时间 适用菌种定期移植低 4低温 无 数月，短期

5、 各种微生物细胞温保藏法液氮超低 -196-150 甘油或 长期 适用范围最广， 温保藏法 DMSO 微生物、动物细胞甘油低温 -80-70 甘油 1年以上 特别适用于基因保藏法 （-18） 工程菌 沙土保藏法 室温或低温 数年 芽孢杆菌、放线菌、 曲霉菌等麸皮保藏法 20 长期 放线菌、霉菌等蒸馏水保藏法410 较长时间 酵母、真菌冷冻干燥保 干燥后，4脱脂乳、蔗糖 数年 各种微生物细胞藏法 左右低温避光处 最有效，适用范围最广，多数国家级菌种保藏单位常用 原则： 慢冻快溶 原理：利用微生物在-130以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。1. 将10%甘油或DMSO作为保护剂分装与安培瓶（

6、or冻干管）中；2. 将长有菌落的琼脂（or培养液）悬浮于已灭菌的保护剂中；3. 熔封安培瓶口（or盖上冻干管的盖子）。 以1min下降1的速度降至-35 ，使瓶内悬浮液体冻结，然后将安培瓶置液氮罐（or液氮冰箱）中，于-130 以下储藏； 恢复培养时，从液氮中取出安培瓶（or冻干管），立即于3840 水浴中摇动，至瓶内冰全部融化，按常法进行培养。 在超低温冷藏柜（-70-80 ）中保藏菌种的一般方法是：1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3加入等体积的20甘油或10二甲亚砜；4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70-80超低温冰箱中保藏。超低温冰箱的冷

7、冻速度一般控制在1-2min。一些细菌和真菌菌种可保藏5年而活力不受影响。 低温冰箱超 冻干保藏：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的非常有效的方法之一。 冷冻干燥步骤： 冻干样品的准备：准备菌种，与保护剂混合均匀，分装至安瓿管； 预冻：2小时以上，温度达到-20到-35左右； 冷冻干燥 ：8-20小时； 真空封口及真空检验 ：安瓿管颈部用强火焰拉细熔封。氯化钴溶液检测真空度； 低温避光保藏 ： 4。 冻干保藏特点： 冻干状态下一般可保藏10年不丧失活力； 冻干后的菌株可常温保存；便于运输； 必须使用冷冻保护剂，常用脱脂乳、蔗糖等。 保藏机构

8、国外：美国标准菌种收藏所，美国，马里兰洲，罗克维尔市。冷泉港研究室，美国。3. IAM (Institute of Applied Microbiology), University of Tokyo, Japan日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。4. IFO (Institute for Fermentation), Osaka, Japan发酵研究所，日本大阪。5. KCC (Kaken Chemical Company Ltd, Tokyo, Japan科研化学有限公司，日本东京。6. NCTC (National Collection of Type Culture), Lond

9、on United Kingdom，国立标准菌种收藏所，英国伦敦。国立卫生研究所，美国，马里兰洲，贝塞斯达。美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市。中国，1970年7月，中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCMS），中国科学院负责，下设六个菌种保藏管理中心。l）CCGMC 普通微生物菌种保臧管理中心；北京、武汉2）ACCC 农业微生物菌种保藏管理中心；北京3）CICC 工业微生物菌种保藏管理中心；北京4）CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心；南京、北京5）CACC 抗生素菌种保藏管理中心；北京、成都、石家庄6）CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心；北京 衰退的表现：生长、代谢（产品）；

10、衰退的原因：保藏不妥，菌种生长的要求没有得到满足（不利环境，回复突变等）； 防止衰退的方法：1. 分离复壮2. 合理改变培养条件3. 减少传代次数4. 诱变剂处理后重新分离单菌落 复壮：分离单细胞，抗性筛选，苛刻条件 将保存在沙土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 菌种扩培的目的 提供相当数量代谢旺盛的种子 -量、状态的需要； 菌种扩培的任务 得到纯、壮、多的培养物 - 菌种的驯化； -缩短发酵时间、保证生产水平。 种子扩培的两个阶段 实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱

11、、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将其称为实验室阶段的种子培养。 培养基：保证培养基的质量，有利于菌体的生长；减少传代次数孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月。 生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。 培养基：控制成本，驯化；营养比发酵培养基丰富。 三级发酵流程：斜面 一级种子 二级种子罐 三级种子罐 发酵罐 静置培养法：嫌气发酵 液体培养法 通气培养法 表面培养法 固态培养法 回转式 往复式 解 释 特 点 适用范围 固态培养 即曲法培养，源 酶活力高 酿造业 于传统制曲技术 可调温

12、湿度 液体深层 液体培养， 可调节各种环境 几乎所有好气发 培养 深层通风 因素：营养物浓度， 酵：如有机酸、 温湿度等；无菌操 氨基酸等 作要求高 载体培养 可重复使用的多孔 兼具固体培养法与 可培养霉菌、酵 材料，严格控制营 液体培养法的优点 母、放线菌等 养条件，结束后挤 压培养液抽提产物 两步法液 将营养生长期与生 工艺可达到最优 氨基酸生产 体深层培 产期分开，分别控 过程繁琐 养 制不同条件 种子的要求： 总量及浓度能满足要求； 生理状况稳定，个体与群体； 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长； 无杂菌污染。 种子的质量控制： 一定的浓度； 形态（生长）处于某个阶段、均匀等等； 理化

13、指标：C、N、P的含量，pH，酶活等； 无污染； 通气与搅拌； 泡沫； 染菌的控制； 种子罐级数。 种龄 种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。 接种量的确定： 移入种子的体积 接种量 接种后培养液的体积 过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。 双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。 倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。 发酵级数的确定： 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始

14、计算发酵级数 确定依据： 发酵规模、菌体生长特性、接种量级数大，难控制、易染菌、易变异，难管理，一般2-4级； 谷氨酸的三级发酵： 一级种子（摇瓶）二级种子 （小罐）发酵 青霉素的三级发酵： 一级种子 （小罐）二级种子（中罐）发酵2.3 种子扩大培养举例 例一、谷氨酸生产的种子制备： 斜面菌种 一级种子培养 二级种子培养 发酵1、 斜面 (AS1.299) 培养条件：32，生长18-24小时 培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细 生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次2. 、一级种子（摇瓶） 培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1% 培养条

15、件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32培养12小时。 培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基。3. 二级种子(种子罐) 培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5% 培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32培养7-10个小时 培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基。 种子的质量要求： 108-109个/ml、大小均匀，呈单个或八字排列，pH 7.0-7.2时结束，6.887.0-7.2，活力旺盛。 例二、青霉素生产的种子制备 安瓿管 斜面孢子 大米孢子 一级种子 二级种子 发酵1. 斜面孢子 培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25、7天, 注意湿度50%左右 培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细2. 大米孢子 培养基：大米及氮源（玉米浆） 培养条件：25、7天，控制湿度 培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。 大米孢子的要求：1粒米含1.4×106