肝糖原的提取、鉴定与定量-第七实验室

1、生物化学实验报告姓 名:学 号:专业年级:组 别:南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称 Folin-酚试剂法测定蛋白质含量实验日期 实验地点合作者 指导老师评分 教师签名 批改日期格式要求:正文请统一用 :小四号, 宋体, 1.5倍行距; 数字、 英文用 Times New Roman; 标题用 :四号, 黑体, 加粗 。 需强调的地方请用 蓝颜色标出。 不得出现多行、 多页空白现象。一、实验目的1、学习并掌握肝糖原提取和鉴定原理和方法;2、学习并掌握蒽酮比色测定糖原含量的原理、注意事项和操作方法;3、学习并掌握刻度吸管和微量加样枪的使用方式;4、正确掌握使用离心机的方法步骤;

2、5、熟练运用溶液混匀的各种方法;6、正确掌握溶液转移的操作;7、正确掌握使用分光光度计的方法步骤二、实验原理实验 1肝糖原的提取与鉴定糖原是生物的主要储能物质之一,主要储存与肝细胞中,采用研磨匀浆等方法可以使肝 细胞破碎。肝细胞破碎,细胞内容物流出。低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性,破坏肝 组织中的酶并且使蛋白质沉淀,糖原则能够稳定地保存在上清液中,从而达到分离糖原与蛋白质等其他成分的目的。 糖原不溶于乙醇但可溶于热水, 故可以先用 95%乙醇将滤 液中糖原沉淀,再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中葡 萄糖长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。此外,糖原

3、还可以 被酸水解成葡萄糖,利用呈色反应和葡萄糖的还原性,可以判定肝组织中糖原的存在。 糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热 2min 后会出现砖红色沉淀。CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH22Cu(OH2 + C6H12O6 = 2CuOH +氧化型葡萄糖 + H2O2CuOH = H20 + Cu2O (红色 Cu(OH2 = H2O + CuO (黑色 实验 2肝糖原定量测定糖原在浓碱溶液中非常稳定,故可将肝组织先置于浓碱中加热,以破坏其他成分,保留 肝糖原。 糖原可以被浓酸水解成葡萄糖, 而浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成 5-羟甲基 呋喃甲醛, 该化合物与蒽酮脱

4、水缩合可以生成蓝色的化合物。 该物质在 620nm 处有最大 吸收。糖含量在 10-100g,溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比。利用该反应原理 处理标准葡萄糖溶液,通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。三、材料与方法:以流程图示意1、实验材料(1肝糖原的提取与鉴定样品:1.50g 的鸡肝试剂:5%三氯醋酸溶液、 95%乙醇、蒸馏水、浓 HCl 溶液、 50%NaOH溶液、碘试剂和 班氏试剂仪器和器材:离心机、天平、试管、试管架、研钵、玻璃棒、室温 -100恒温水浴箱、剪刀、镊子、刻度吸管、加样枪和白瓷反应板(2肝糖原的定量测定样品:0.15g 的鸡肝试剂:30%KOH溶液、蒸馏水、标准

5、葡萄糖溶液和 0.2%蒽酮溶液显色剂仪器和器材:室温 -100恒温水浴箱、比色皿、 100ml 容量瓶、分光光度计、试管、剪 刀、镊子、刻度吸管和微量加样枪3、实验步骤与方法(1肝糖原的提取与鉴定: 图一:肝糖原的提取与鉴定实验流程(2肝糖原定量测定 图二:肝糖原定量测定试验流程 取 3 支试管，按下表操作。 试剂（ml） 蒸馏水 标准葡萄糖溶液 糖原提取液 0.2%蒽酮溶液 空白管 1.0 2.5 标准管 1.0 2.5 样品管 1.0 2.5 表一：糖原测定试管操作 混匀， 沸水浴 10 分钟， 冷却至室温。 在分光光度计 620 nm 波长处， 用空白管溶液调零， 测定各管溶液的吸光度（

6、A） 。 四、结果与讨论：结果：实验数据、现象、图谱；讨论：以结果为基础的逻辑 推论，并得出结论。 1、实验现象 实验一：肝糖原的提取与鉴定 所获糖原溶液如下图： 图三：所获糖原溶液 所获糖原溶液呈乳样光泽。 将糖原溶液滴到碘试剂中可以勉强看到溶液出现浑浊，砖红色沉淀不明显，说明样品 鸡肝中糖原含量少。 碘液+蒸馏水 碘液+糖原溶液 图四：糖原溶液与碘试剂反应 糖原水解液与班氏试剂混合后溶液变深蓝。沸水浴加热 2min 后，产生浑浊，砖红色 沉淀不明显，说明样品鸡肝中糖原含量少。 沸水浴前 沸水浴后 图五：糖原水解液与班氏试剂混合沸水浴后 实验二：肝糖原的定量测定 空白管、标准管和样品管混匀呈

7、现如下颜色反应 空 白 管 标 准 管 样 品 管 图六：加入蒽酮溶液并且水浴过后的空白管、标准管、样品管（由左至右）对比 2、吸光度数据记录： 620nm 波长吸收度值记录 各管吸光度值 A620 测定次数 空白管 1 2 3 各管平均值 0 0 0 0 标准管 0.672 0.671 0.672 0.672 样品管 0.099 0.101 0.102 0.101 表二：620nm 波长吸收度值记录表 3、结果计算： A样品 100 100 ´ 0.05 ´ ´ ´ 1.11 肝组织重（g） 1000 根据公式：肝糖原（g/100g 肝组织）= A标准

8、 计算结果得样品肝糖原（g/100g 肝组织）=0.56g/100g 肝组织 故本次实验结论为：该鸡肝样品含有肝糖原，且肝糖原含量为 0.56g/100g 肝组织。 4、结果分析 经查阅资料得：饱食鸡肝的肝糖原含量为：23g/100g 肝组织，而本次实验测得肝糖原 =0.56g/100g 肝组织，即本次实验测得的肝糖原含量偏低。 5、讨论总结 （1）与碘试剂反应时：加入糖原的孔穴并没有出现预期的明显红棕色。究其原因，在 取糖原沉淀时，沉淀很少，糖原含量也很少。而又因为碘试剂本身是黄色的，本来现象 就不是很明显，这样一来，几乎看不到反应会产生的红棕色了，说明糖原含量极少。 （2） 糖原中葡萄糖的

9、鉴定： 实验结果也没有如预期中的蓝色溶液沸水浴后变为砖红色。 原因还是糖原含量极少，又加过少量酸与碱，浓度更小，现象更不明显，所以观察不到 明显的砖红色。 （3）在肝糖原定量测定中，三只试管水浴 15min 后，标准管颜色最为明显，为绿色， 加入的是标准葡萄糖溶液，样品管与空白管颜色依次递减。 （4）由资料可知饱食鸡肝糖原含量宜在 23g/100g 肝组织，而本次实验测得肝糖原为 0.56g/100g 肝组织，偏低。究其原因，实验中操作没有失误，与其他小组和其他实验室 对比，发现各小组结果均偏低，可以推测，实验现象不明显原因是鸡肝材料糖原含量偏 低。 6、结论：本次试验为肝糖原的提取、鉴定与定量 ，通过这次实验掌握了组织样品的 制备