质谱定量的原则系列讲座

1、质谱定量的原则系列讲座（转自分析测试百科叮当空间）质谱定量的原则01-目录：1质谱定量的简介a) 总离子流b) 选择离子监测（SIM）c) 选择反应监测（SRM/MRM）2开发一个SRM方法3内标4PK/LC/MS/MS 药物代谢动力学的LC/MS/MS的反相液相色谱的方法开发5样品制备6标准和标准曲线的准备a) 做标准曲线的步骤b) 标准曲线的稀释方案Scheme的举例c) 标准曲线的运行d) 进行标准品和样品的随机化e) 系统运行的实用性f) “QCs”质量控制7相关的PK资源8定量的技巧Tips质谱定量的原则02质谱定量的简介和LC/MS监测的模式简介本教程主要用于：使用质谱作小分子药代

2、动力学分析，即PK/MS。除此之外，这些同样的原则也可用于生物基质中肽和蛋白的定量。传统上，在使用现代质谱定量之前，定量是用HPLC高效液相色谱和UV紫外检测器实现的。HPLC 药代动力学分析建立在保留时间、峰面积和紫外光谱性质的基础上的。HPLC方法的缺点是灵敏度不够、缺乏特异性。我们已经看到一些实例，一个化合物的确已经代谢了，然而保留时间和紫外光谱上，母离子和代谢物无法区分。这种缺少特异性的分析时不时会误导研究者。所以在药代动力学分析中，基于质谱的表征现在是一种新型的重要的工具。质谱定量中已经被广泛接受的方式是MS/MS定量。这种定量常通过三级四极杆或离子阱质谱实现。要求使用MS/MS的原

3、因是：许多化合物有同样的质量。当使用第一个维度即单级质谱MS去定量时，也会缺乏特异性，尤其是对于像血液那样的复杂的基质。第二个维度的MS（即MS/MS）在大多数情况下，能够提供唯一的断裂。合并特异的母离子质量和唯一的碎片离子信息，可以选择性地监测被定量的化合物。下面我们将讨论获得和可视化LC/MS数据的方法。获得和可视化LC/MS的数据，或称为：质谱数据如何在一个LC/MS实验中表达？典型的方法，质谱被设置为扫描特定的质量范围。在全扫描分析中，质量扫描范围较宽；在选择离子监测SIM时，质量扫描范围较窄。依赖于扫描的类型，一个独立的质量扫描时间可以从10 ms到5秒。在一次LC/MS分析中可获得

4、许多个扫描。LC/MS数据的表示方法为：把每个质量扫描的离子流信息叠加，画出随时间变化的总离子流，横轴是时间，纵轴是强度。总离子流图非常像HPLC的紫外图，见图1。下面我们将讨论各种扫描的模式，和这些模式同质谱定量的关系。最常见的LC/MS数据模式为：（1）   总离子流图（2）   选择离子监测（SIM）（3）   选择反应监测（SRM）或多反应监测（MRM）：MRM和SRM本质上是同样的实验模式。 全扫描分析图1 图1.gif (2.85 KB)2007-7-17 17:00从药代分析中得到的全质量范围的总离子流图（TIC）非常像

5、HPLC UV图，除了：质谱能检测到更多的化合物，尤其是没有紫外吸收的化合物。总离子流是一个叠加图，叠加了每个质量扫描的离子流。当一个小分子或小肽流出HPLC色谱柱时，相对强度上升，在TIC图上出现了一个峰，横轴是时间。每个质量的化合物都被记录在TIC图上。找出感兴趣的化合物可能是困难的，因为许多化合物有相同的质量。化合物的天然质量不是鉴定的唯一性数据。设置一个确定的质量，可以画出一个提取离子流图，但这个图的强度会比下面介绍的SIM实验中的强度低。（注意：TIC指的是在一段时间内采集的质量扫描数据，不特指扫描范围或质谱实验的类型。例如，我们可以在SIM或SRM实验中获得TIC图。然而，为简单起

6、见，我们将把这些图称为SIM和SRM图，而不是SIM TIC图。）Selected Ion Monitoring选择离子监测 在选择离子监测中，质谱被设置为扫描一个非常小的质量范围，典型的是一个质量数的宽度。选择的质量宽度越窄，SIM的确定度越高。SIM图就是从非常窄的质量范围中得到的离子流图。只有被该质量范围选择的化合物才会被画在SIM图中。图1和图2是同一个样品的谱图，然而它们看起来很不相同。原因是在SIM图中，画的是TIC图中较少的组分。SIM图是比TIC图更确定的图。图2图1.gif (2.85 KB)2007-7-17 17:00然而，SIM图仍显示了许多峰，不能唯一地确认我们感兴趣

7、的化合物。一个复杂的样品（比如血清或血浆）中，这样的图是一个典型的SIM图。许多化合物有同样的质量，在ESI中还有多电荷峰也和我们感兴趣的化合物有同样的m/z值。SIM实验比全扫描实验更灵敏，因为质谱在一个更小的质量范围上驻留（dwell）更长的时间。Selected Reaction Monitoring选择反应监测 （SRM）SRM被大多数科学家在质谱定量中使用，见图3。SRM中，可以监测一个特征的唯一的碎片离子，在很多非常复杂的基质中进行定量。SRM图非常简单，通常只包含一个峰。这种特征性使SRM图成为灵敏度高且特异性强的理想的定量工具。图3图3.gif (2.36 KB)2007-7-

8、17 17:00SRM的过程：选择一个特征的母离子做MS/MS，在其碎片中选择一个特征的子离子作为监测离子。可以把SRM理解为碎片离子的SIM。这种特征性的实验被成为“transition”（跃迁），可以表示为：母离子 子离子，举例：534 375质谱定量的原则03建立一个SRM Transition 534 375一个定量分析方法应该是特征性的、高准确度和高灵敏度的。在不牺牲上述特性的前提下，建立方法应该尽可能地快速，质谱定量可以很好地满足这些规则。在建立一个感兴趣的化合物的MS/MS碎片transition的时候，一种优化transition的方法是用注射泵进样（syringe pump）

9、该化合物来优化。先在全扫描方式中优化母离子信号。因为MS/MS的灵敏度将依赖于化合物在全扫描模式中是否响应得好，要尽可能地优化全扫描的、非CID响应的MS信号。然后优化碰撞能CE和碰撞气体，给出丰度最高的碎片离子。不能使用太大的碰撞能CE，因为太大的CE会丢失稳定的、有价值的碎片峰。“我应如何优化碎片峰？”可以用注射泵进样化合物，进行MS/MS，挑出一个稳定的碎片峰，当改变碰撞能和碰撞气体参数时监测它的离子流。最后当获得最大的碎片离子峰响应时确定碰撞能和碰撞气体参数。现代的三重四极杆质谱都可以自动优化。图4.gif (3.32 KB)2007-7-17 17:09从优化好的MS/MS谱中，选择

10、一个合适的碎片峰用于定量监测。如图A所示，母离子质量为534，似乎从图B中可以很容易选择一个碎片峰做Transition。一个基本考虑是尽可能不要选择离母离子太近的质量。非常常见的，是化合物的失水峰或失氨（ammonia）峰，例如：53451717。我们应尽可能不要选择失水峰或失氨（ammonia）峰做SRM，因为这会导致一个不是很特异的transition。这里，Transition 534 375是一个好的选择。另外要注意的是：要选择一个稳定的峰。当直接进样化合物时，被选择做Transition的峰必须每次扫描响应都一致。提示：当优化MS条件时，最好能模拟实际做样的条件。例如：实际做样时色

11、谱流速是400 ul/min，化合物在30%有机相时流出，用注射泵进样优化MS条件时最好模拟这个条件，即设置HPLC流速为400 ul/min，30%有机相；然后用三通注入化合物。同时，第一次优化实验时，我们可以选择60/60的梯度，去表征化合物的疏水性，从而得知它在C18反相柱上的色谱行为。如果你对所有的化合物都按这样的方法实验，你就可以建立一个洗脱数据库，可以作为将来实验的参考。注： 60/60梯度的意思是：梯度从近100% 水相开始，在60分钟内到达60%有机相。质谱定量的原则04内标 在做MS定量时应该使用内标。选择一个合适的内标，将能减少因为样品提取、HPLC进样和离子化的多样性造成

12、的差异。在复杂基质的分析中，在SRM积分图上，在标准曲线的低端，常会见到：两个不同的浓度水平，会给出近乎一致的响应。只有当使用一种内标时，这两个点才能被区分。一些研究者试图在实验中不用内标去做标准曲线，但成功率不高。我们在标准曲线上每个浓度水平都重复进样3次。没有内标的情况下，重现性RSD常常会高于20%；而当使用内标时，%RSD能降低到近2%。我要如何选择一个内标?最好的内标是待定量的化合物的同位素内标。同位素标记的内标将和待测物有相似的回收率、ESI离子化响应，和相似的色谱保留时间。如果你运行的不是临床药代动力学定量，可能很难判断上述说法，因为特殊的合成一个同位素标记的内标，是非常昂贵和耗

13、时的。通常，如果你和一个医学的化学家工作，他们会有一个化合物相似物库，可以被用作内标。这些类似物，在化合物合成中被测试，和该化合物性质相似可以被用户定量内标，而且更重要的是，这些类似物和该化合物的母离子质量有微小的差异。尽量不要使用去甲基化（14）或者是氧化的（16）的类似物作内标，因为待测化合物的母离子常会发生同样的代谢。常见的做内标的类似物是氯代的化合物。氯代的化合物类似物会和待测化合物有相似的色谱保留时间，这是内标的一个重要特性。我们已经发现内标物的一个最重要的特性是它和待测化合物共流出。我该如何使用内标？首先，内标添加需在样品测试方法的开始阶段，典型的，应在血浆crash或固相萃取之前

14、。内标应用同一浓度水平添加（包括标样）。内标应给出可靠的质谱响应。应该注意的是：内标的量应添加得合适，应高于定量限，但不能过高，因为过高的内标响应会抑制被分析物的离子化。“我应该添加多少量的内标？”这是一个重要的问题。通过做一些试分析：早、中、晚的时间点，也许一个或两个标准点，你应该知道你的样品中化合物的大概量。这些信息非常有价值，可以帮助建立一个合适的标准曲线，并知道应添加多少量的内标。举例来说：如果待定量的样品浓度范围是100 fg 25 pg，检测限是100 fg，你应该添加510 pg的内标。一个好的经验法则是：内标物的量大概是标准工作曲线浓度最高点的1/3。这将给出一个比较不错的响应

15、，并且不会抑制和干扰待测样品的离子化。见图1图1 内标的量（内标.gif）质谱定量的原则05液相色谱串联质谱联用药代动力学方法开发更快就是更好！在每一个药代动力学分析中更快就是更好！样品组/系列包括：重复的标准品，QC质控样品，和样品，加起来大概要进行300次分析。如果每个样品实验耗时15分钟，整套分析要75个小时。高要求的实验（加上质谱）总计要超过3天时间。一些该领域的研究者可以只花12分钟分析一个样品；而大多数的PK/MS的实验室一般很容易做到花34分钟分析一个样品。如果对上面同样的300个样，4分钟一个实验的话，总分析时间可减少到20个小时。所以，每分钟都是很重要的！在2mm×

16、 3050mm反相短柱上可以获得快速的梯度和快速的平衡时间。LC/MS的非药动实验中，流速一般为200 µl/min.，而在LC/MS的药动实验中，流速一般设为400 1000 µl/min。更快的流速有助于加速洗脱和平衡。下面是典型的LC/MS药动实验条件：LC/MS药动实验方法：色谱柱：2.1 X 50 mm, 5 µm , 100 Å , C18柱温： 40流动相：A 为水相（0.1% 甲酸），B为乙睛（0.1%甲酸）流速： 400µl/min梯度： Time(min.)%B0252802.125425Notes：a ) 调节初始的B使其

17、适应该化合物 b ) 试着减少梯度时间到1分钟以缩短方法时间 优化梯度：当然你要对每个化合物特别的进行方法优化。我们推荐创建一个色谱数据库，详细地记录实验室接手的各个化合物的疏水性（可以运行60/60方法完成）。当你需要挑选一个相似疏水性的内标时，这样的色谱数据库将非常有用。在长时间的梯度中，B的起始值一旦明确，那么在缩短时间时，就把B的值降10%。举例来说，如果B初始值是40%，那么在运行液质药动方法时，起始值%B就是30%。这种方法将确保你的化合物可以留在你的柱子上。优化柱子和流动相：在上面举例的液相条件中，一些化合物有可能响应得不好。一些化合物可能要求不同的有机改性试剂或有机相。一般，磷

18、酸盐不适用于质谱。有些人用1020mM低浓度的醋酸铵作A相缓冲盐。另一些人合并甲醇和乙睛在B相中。如果你的化合物峰形不好，需要改变几个或者所有的实验参数。必须选用合适的柱子去获得好的回收和好的峰形。帮助提示：1）一个质谱实验室可能要整日忙着做色谱方法开发，尤其是如果这个实验室每周要接510个新化合物样品。在组合化合物和它们的内标，进行组合的色谱方法开发方面我们颇有心得。并不是所有的化合物适用于这种方式，但是这个方法为我们节省了大量的方法开发的时间。当我们发现做6个化合物混合样的方法开发时间，和一个化合物的几乎一样时，这个在新的组合给药（cassette dosing）方法开发中，该方法就变得非

19、常有用。注：cassette dosing 是一种新的给药方法，称为盒式给药法，又称为组合给药技术，由Ber- man等提出，即给动物同时服用几种药物，按常规取样时间取血，运用 HPLC联用技术进行样品处理分析。2）加速方法开发。许多常见化合物如布洛芬已经有人建立了方法，检索一下文献、互联网和USP的出版物，查到这些方法。不要浪费时间从头开始! 3）组合给药技术常常加速化合物筛选过程。许多研究者不愿做组合实验技术，是因为害怕药物-药物相互作用。一种可取的方式是给药后合并化合物。合并上述的方法开发方法，可以为任务重的实验室节省大量的时间。4) HPLC自动进样器往往是出奇的慢，记得在平衡时间里考

20、虑自动进样器，因为当自动进样器工作时，柱子是在初始化（initial）条件下被清洗的，必须在平衡时间里考虑这个时间。你可以从方法里砍掉3060秒的平衡时间。要分秒必争嘛！从300个样品分析中，每个砍掉3060秒，就是5个小时啊！质谱定量的原则06样品的制备（适用于液质药动分析的样品制备）样品一般在血浆或血清中。离心去除血液里的血细胞获得血浆。血液凝固后去除固体得到血清样品。凝固血液清除血液细胞和凝血因子。血清比血浆易于处理，因为凝血因子已经被去除。当使用储存的血浆时，常会发现蓬蓬的凝块物，使样品很难进入吸液管pipette。不管是血清还是血浆，在进入反相柱分析前都要作进一步的处理。下面会讨论几

21、种的方法用以制备可以用作液质药动分析的血浆和血清样品。血浆破碎（crash）（有时称蛋白沉降）血浆破碎/蛋白沉降是最常用的方法，因为它一般不要求特殊的仪器。用乙睛或甲醇沉淀去除丰度的白蛋白。一个典型的方法描述如下：前处理血浆蛋白沉淀.jpg (26.75 KB)血浆破碎（crash）/蛋白沉降方法：1）放50?l血浆或血清在0.5毫升管中2）加10?l内标3）添加140?l冷(冻)的有机溶剂（乙睛或甲醇）然后涡旋4）冷冻样品2小时5）稍稍离心样品，分离出沉淀的蛋白6）取150?l上清液至一干净管，加150?l液相的A相(水相).在这时，样品里含的有机相大概为38。如果你的化合物要求更低的有机相

22、，来保留在色谱柱上，应增加第6）步添加的水相的量。7）把6）项的样品，进行HPLC进样做液质联用的药动分析。固相萃取：许多人首选固相萃取法SPE。在SPE中，血浆或血清被直接加入一个疏水的固相中，一般是C18小柱。加入后，用有机相淋洗小柱，则感兴趣的小分子会被洗脱下来。SPE可以是手动的，也可以是小批量的。手动的SPE制备方法限制了样品的通量。可以用96孔板做自动化。一些人认为96孔板非常贵，一个96孔板大约为100美元，但是痕量成本时应该考虑易用性和最终产品的贡献。一些人发现：用于液质联用药动分析的最终洗提液（eluant）质量更好，反相柱的附着物和质谱信号的滚动（roll-off）发生在较

23、低的速率。液液萃取：必须承认我们在这方面没有很多经验。这里是我所知道的。液液萃取只工作在那些可以分隔进入有机相的化合物。它可能是一种样品净化的有效方法。然后，这种技术很难自动化。药代的各种样品处理药代的各种样品处理.jpg (97.48 KB)2007-7-17 23:29这是一个补充的图，一种列表的方式，介绍各种前处理。 各课题组，都根据自己的需要选择方式。 梦想的方法是：简单的沉淀、离心蛋白法。这时候可能有堵的问题，因为处理非常简单，也许会堵。所以各个用户买液质的时候会问卖液质的销售一个silly question：你们的仪器是不是可以直接做沉淀蛋白的，而不堵啊？ 问的可爱，答的

24、“精彩”！质谱定量的原则07质谱药动定量分析的标准物和创建标准曲线简介 完整的定量分析依赖于参考标准的质量。一种合格的参考标准，应能通过（pass）一系列定性参考标准的测试。参考标准的定性测试要设计为：充分地表征参考标准的质量和含量。如果参考标准的含量不对，那么建立在其上的定量分析一定是错的。然而，当进行“研究性药动”时，可能没有足够的时间去充分地表征化合物，因为很简单，在一周内，实验室要做三种新化合物。所以，当面临开发一种“研究型药动”方法时，实验室应努力建立一个假定的参考标准，在做整套化合物实验室保持不变，而且实验室能够永久地获得该假定参考标准，用于日后的参考。这个步骤能确保：每个相对于这

25、个假定的参考标准的药动实验能够被测量。创建标准曲线的步骤在定量分析中也至关重要。为了使分析可靠，这个参考标准必须可靠，在创建标准曲线上的每一点时，每一次称重和取液都必须准确无误。下面我们介绍，在液质药动定量分析中典型的创建标准曲线的方法。 创建标准曲线 汇集所有可能知道的关于未知样品浓度范围的信息，可以有计划地绘制标准曲线。以前曾介绍过一个快速的估算方法，早、中、晚的时间点伴随着低、中、高浓度的标准。鬼峰将允许创建一个更适当的标准曲线范围，并会告诉你应注入多少量的样品。这些步骤可以使你免于重复长时间的开发。有些时间点可能包含高浓度的目标化合物。这个初步的分析可以告诉你是否稀释，例如，最早的时间

26、点乘以10倍，让你建立一个更合适的标准曲线。标准曲线稀释方法举例（你用的实际步骤可能与此区别很大，只把这个例子作为参考）在下表中的稀释步骤描述了一个3X, (3X50 µl)制备过程，以表达最能模拟未知样品制备的实际情况。这个表包括了：加入有机溶剂做蛋白沉降。标准样品的制备和用于分析的注入的体积，应该反映未知样品的分析工作。称出大约1毫克的参考标准,并重组为一个10 ug/毫升，称量不到1毫克可能增大称重误差的可能性并传递误差。一些疏水化合物可能要求两步的重组。例如，一种疏水化合物可能不能溶于含水量高的溶液。试着在少量的DMSO中溶解这种化合物，然后在含最低量有机溶剂的溶液（这时化合

27、物是稳定和可溶的）中重组。供应这些化合物用以评估的药用化学家，常常给出你关于溶解度和稳定性的建议。（警告：这种稀释方法可能会出错，你必须验证它。）参考标准浓度=10 µg/毫升（在不含血清的溶液中制备）溶液 A = 1 µg/ml     (100 µl 参考标准 + 900 µl血清) 溶液B = 100 pg/ml (10 µl参考标准 + 990 µl 血清) 溶液 C = 10 pg/ml   (10 µl参考标准 + 9990 µl 血清) 溶液

28、D = 1 pg/ml     (10 µl 溶液 B + 990 µl 血清) 图.jpg (36.36 KB)2007-7-18 14:13下载标准曲线法 standardcurve.rar (4.23 KB) standardcurve.rar (4.23 KB)下载次数: 492007-7-18 14:11（注意这个稀释程序可能有错，你必须验证它）方法注意：1   在加入有机物沉淀蛋白前，内标应与样品充分混合。尽可能地加入低浓度有机相的内标，这样不会引起永久的沉淀。如果可能的话，用在血清中制备的内标储液最好

29、。2   溶液A，B，C和D应该在血清中制备，这样标准曲线的样品更接近未知的、在基质中的实际样品。3   当创建标准曲线时，应避免系列的稀释。因为如果在第一次稀释时，如果犯了一个错误，那么系列的稀释将造成错误漫步在整个标准曲线上。4   在配置溶液时，不要吸取< L的液体，更小的体积将导致更大的误差。并且，确保你的移液管是校正过的。m10 5   用于这个步骤的血清总量是12.7 mL。运行标准曲线：由于标准曲线常常跨越三个（浓度）数量级，通常，标准样品从低浓度高浓度依次做样。这个步骤保证不受高浓度标样的色谱交叉污染。在标准曲线运行完后，要进几针空白，直到看不到明