中药含药血清药理研究方法精讲

1、中药含药血清药理研究方法inPharmacologicalmethodofthedrug-containedserumforChineseMateriaMedicavitro概述中药血清药理研究方法：是指动物灌胃给予中药及制剂，经吸收进入机体血液循环，在一定时间内采取血液，分离所得血清，必定含有一定量的该药物成分，此时的血药浓度反映了机体的真实血药浓度，以此血清加入到体外细胞培养体系，观察其药理作用的体外实验方法。中药血清药理学研究方法的意义：1、 采取的含药物血清与机体内环境相一致且排除了中药制剂的各种影响因素（如pH，渗透压等），将其加入到体外细胞培养体系，观察其药理作用，具有更好的科学性

2、，可行性；同时，使中药的研究易于深入到细胞分子水平，对于创建中药细胞分子药理学研究具有重要的促进作用。2、 于灌胃给药后不同时间采取的血清，其体外药理实验的效应及其变化，可以反映机体真实的血药浓度及其变化，无疑开创了对于许多成分不明或复方中药制剂药动学研究的一种新方法。3、 如采用中药血清药理学方法进行中药药效学研究时，同时分析测定血清中药物成分的含量，具有极强的针对性，可避免盲目地筛选药物有效成分的繁重工作，使中药药效与中药成分的研究更能协调一致。从1988年日本学者田代真一正式提出了“血清药理学”这一新概念，至今已有十余年时间。其研究主要经历了三个阶段：1、 可行性探索研究2、 方法学研究

3、3、 应用研究阶段。可行性探索研究以含药血清进行体外的药效学试验，早在上世纪五十年代国内即有所探索，自田代真一提出“血清药理学”的概念以后，重新引起了学术界的广泛关注。国内学者对其进行了广泛的可行性探索研究。一.抗菌、抗病毒的实验研究杨奎等应用中药血清药理方法进行了中药体外抗菌实验，发现黄芩、藿香正气水、藿香正气液的血清分别具有明显的抑菌作用，抑制率高达70以上。该研究发现一些含中药血清相对于正常血清表现为促进细菌繁殖作用，表明一些中药可以降低机体抗御外邪的能力。同时，该研究还发现，不论是中药复方，还是单味中药，均可出现多个抑菌高峰，表明中药抗菌有效成分复杂，其吸收高峰不相一致，可以对细菌给予

4、多次打击，有利于抑制其繁殖。崔晓兰等应用口饲桂枝汤的含药血清进行研究，发现每日1次连续3天，末次给药后2小时的血清有明显抑制副流感病毒致细胞病变的作用，该研究还发现，桂枝汤煎剂本身并无直接抗副流感病毒作用，而口饲桂枝汤后的中药血清则有明显作用。因此，血清药理研究可以防止假阴性实验结果的出现。二.对单核细胞产生内生致热原的研究杨奎等观察了口饲黄芩、香薷、羌活胜湿汤、九味羌活丸的含药血清对家兔单核细胞内生致热原产生过程中单核细胞内DNA、蛋白质合成速度及Ca2+内流的影响。结果显示，口饲黄苓的含药血清能明显抑制单核细胞内DNA合成，抑制Ca2+内流，并推测出黄苓解热机理之一是通过抑制单核细胞内DN

5、A合成，抑制Ca2+内流而阻断内生致热原的合成。含香薷血清、含羌活胜湿汤血清、含九味羌活丸血清三者对单核细胞内DNA合成均有明显抑制作用；对单核细胞Ca2+内流的影响，香薷和九味羌活丸均呈量效递增性抑制作用；时效关系表明，九味羌活丸对Ca2+内流的抑制作用在给药后90min达高峰，对DNA合成的抑制作用在给药后30min和90min作用较明显。三.抗肿瘤作用的实验研究王力倩等采用中药血清药理研究方法进行离体试验，观察了含苦参、仙鹤草的血清及其煎剂对肿瘤细胞体外生长的影响。结果发现苦参、仙鹤草煎剂及含苦参血清均有明显的抗肿瘤活性，而含仙鹤草血清则无效。初步证明苦参对肿瘤细胞体外生长确实有一定的细

6、胞毒性作用，而含仙鹤草血清及其煎剂出现了不同实验结果的原因，可能与中药粗制剂因素有关，也可能受药物在体内代谢过程及血清等因素的影响。该研究提示，含药血清药理研究对中药抗肿瘤作用的评价有一定的意义。四.对造血系统的实验研究张英华等用血清药理方法研究了当归补血汤对造血祖细胞的影响，发现含当归补血汤的血清对小鼠粒系一巨系造血祖细胞（CFUGM）、红系造血祖细胞（CFU-E）的增殖有明显的促进作用，随着含药血清量的增加，CFUGM、CFUE的增殖数越高。提示当归补血汤能刺激骨髓造血祖细胞，从而有可能增强粒系一巨系、红系细胞的生长、成熟而达生血补血的作用。拆方研究表明当归补血汤刺激粒系、巨系造血祖细胞增

7、殖的作用主要源于当归，而对红系造血祖细胞的作用以黄芪为主。表明当归、黄芪对不同的造血祖细胞的作用各有侧重，又互相合作，共同调节机体的造血补血机能。而当归补血汤煎液对CFUGM的生长有抑制作用，剂量越大，抑制作用越强；同时，当归补血汤水煎液不能刺激CFUE的增殖。这与当归补气补血的作用不相符。由此可见，血清药理体外实验方法克服了中药粗提物进行体外实验的弊端，是一种更为科学有效的中药复方体外实验方法。五.对呼吸系统的实验研究董自波等以金荞麦片为供试药物，观察了含药血清对离体豚鼠回肠的松弛作用。结果发现，口服临床等剂量的金荞麦片的含药血清能明显抑制组胺引起的离体豚鼠回肠的收缩，表明金荞麦片具有H1受

8、体阻断剂的作用，能改善气管炎过敏的临床症状，时效关系表明等效剂量的金荞麦片给予豚鼠40分钟出现效应，80分钟到达峰值，160分钟效应开始衰减，效应至少可以维持160分钟。量效关系表明：3倍与9倍临床等效剂量效应呈比例的增加。黄坚等发现小青龙汤药物血清具有显著抗组织胺引起的离体豚鼠气管平滑肌收缩作用，且呈良好的量效关系，与直接煎剂进行离体药理实验具有相似的药理效应。该实验提示小青龙汤中的抗组织胺的有效成分可通过胃肠道吸收，进入血液而起作用，其有效成分的达峰时间约为2小时，表明血清药效实验的可靠性及可信度在某些方面优于通常的药理实验。六.对心血管系统的实验研究张群豪等采用血清药理方法观察到口饲血府

9、逐瘀浓缩丸的含药血清对实验性动脉粥样硬化家兔主动脉平滑肌细胞（SMC）增殖有明显抑制作用，并呈剂量依赖性。血府逐瘀汤煎剂直接加入培养基中也呈现出对SME繁殖的抑制作用，且煎剂浓缩液作用强于含药血清。表明血府逐瘀浓缩丸在体内外确均有抑制SMC增殖的作用，血府逐瘀浓缩丸确含抗SMC增殖的有效成分，并且此成分口服有效。血府逐瘀煎剂浓缩液的抑制作用比含药血清强，可能与某些有效成分未能从消化道吸收或经体内代谢失活有关。王伟等用血清药理研究方法观察到血府逐瘀胶囊、精制血府胶囊、硫氮酮三组药物的含药血清可显著降低缺氧缺糖心肌细胞乳酸脱氢酶（LDHL）、肌酸激酶（CK）、谷草转氨酶（GOT）的释放，且精制血府

10、胶囊组、硫氮酮组更为显著。提示精制血府胶囊组对心肌细胞的保护作用强于血府逐瘀胶囊。刘强等观察了清心饮对大鼠心肌细胞感染柯萨奇B3病毒的影响，发现清心饮的含药血清可明显减轻实验性病毒心肌炎的细胞病变，改善细胞搏动，降低细胞上清液中的病毒滴度，减少感染心肌细胞乳酸脱氢酶、天冬氨酸氨基转移酶的释放，显著抑制柯萨奇B1病毒核糖的复制。清心饮的水煎剂液体体外实验也有上述药理作用，由此提示清心饮中含抗病毒、保护心肌细胞的有效成分，口服有效。针对以往附子强心作用的研究均采用体外实验或静脉直接给药的方法，而无口服给药的结论。陈长勋等采用中药血清药理方法观察了附子对离体豚鼠左心房收缩力的影响。结果发现，与未服药

11、动物血清比较，口服附子粗制剂后动物血清有明显增强心肌收缩力和加快心肌收缩速度的作用，给药后2小时血清作用达高峰。证明附子血清与附子制剂直接给药两者对心肌的正性肌力作用基本相似，说明其强心有效成分确能经胃肠吸收入血，且不会经吸收立即被代谢失活。七.对神经系统的实验研究刘国卿等采用具有典型神经内分泌细胞特征的PC12细胞株为实验模型，用血清药理方法观察了口饲“李氏5号方”的含药血清对神经元的影响。结果发现含药血清作用24小时、48小时、72小时时均能剂量依赖性地促进PC12细胞的增殖，对NaCN加缺糖致PC12细胞缺血样损伤模型表现出明显的抑制和保护作用，并呈现一定的量效关系。江雪华等采用新生小鼠

12、大脑皮层进行体外神经细胞培养，建立离体的神经细胞谷氨酸损伤模型，运用血清方法，进一步观察了含“李氏5号方”的血清对原代培养皮层神经细胞谷氨酸损伤的影响。结果表明“李氏5号方”水煎剂（含挥发油成分）虽能抑制原代培养皮层神经细胞损伤，但作用不如其含药血清强，同时，含药血清抑制神经损伤的药理作用呈剂量依赖性，提示“李氏5号方”可拮抗兴奋性氨基酸神经毒性。八.对肝细胞的实验研究刘成海等观察了扶正化瘀方对培养大鼠贮脂细胞功能的影响，结果表明，该复方血清能明显抑制贮脂细胞增殖，且抑制程度与药物剂量及其血清浓度有关，而且对贮肝细胞内外胶原生成也有一定的抑制作用。季光等研究发现，扶正化瘀方血清能显著促进正常及

13、损伤肝细胞培养上清液中ALT、AST活性，抑制正常及损伤肝细胞的胶原生成率。刘成海等采用扶正化瘀方的血清直接添加于培养的肝纤维化病理形成的重要细胞大鼠肝细胞及星状细胞。结果表明：含药血清能抑制星状细胞增殖、促进肝细胞增殖。提示扶正化瘀方有利于损伤肝细胞的修复、有助于抑制舌状细胞活化及其细胞基质生成，显示该方的抗纤维化作用机理之一。王晓玲等采用血清药理方法进一步研究了扶正化瘀方抗肝纤维的配伍作用，结果表明，扶正化瘀方及其拆方含药血清均可抑制星状细胞的活化、增殖，抑制其胶原、TGF(3i的基因表达与蛋白生成。其中化瘀组抑制增殖和活化的作用最为突出，扶正组抑制胶原的作用最显著，虫草菌丝的抑制TGFB

14、i作用最强。证实了“药有个性之特长，方有合群妙用”。九.对免疫功能调节的研究曾南等23观察了含虫草的血清对IL2活性的影响，发现1.25g/kg剂量组能增强IL2活性，但7.5g/kg、3.5g/kg剂量组作用不明显，相反3.5g/kg剂量组却出现抑制作用，这可能与血清的稀释度及其内容物有关。阴赪宏等应用血清药理方法观察了当归补血汤对小鼠白细胞的活化作用。时效关系研究表明，当归补血汤13.2g饮片/kg体重灌胃小鼠后660min等不同时相的含药血清对小鼠白细胞均具有活化作用，量效关系表明，当归补血汤6.6033.0g饮片kg体重分别灌胃小鼠后的含药血清对小鼠白细胞均具有活化作用。十.对泌尿系统

15、的实验研究赵宗江等用血清药理方法，观察了含温阳降浊汤药物成分的大鼠血清对体外培养的肾小球系膜细胞（MsC）增殖有明显的抑制作用，且与血清中的药物含量成正比例关系，提示温阳降浊汤抑制MsC增殖可能是该药防治肾小球硬化、延缓慢性肾功能衰竭进展的重要机理之一。由此可见，中药血清药理研究方法开辟了中药研究的新思路，拓宽了研究领域，提高了中药（尤其是中药复方）体外实验的可信度。在一定程度上揭示了中药和复方在胃肠内处置过程中活性成分的转化和改变。中药含药血清药理的方法学研究尽管在上世纪九十年代中期以前，对含药血清的药理作用及其价值作了探讨，但对其实验方法的各个环节尚缺乏系统地研究；九十年中期以来，国内对中

16、药含药血清药理进行了较系统的方法学研究，包括：1、建立中药含药血清体外药理实验方法意义的论证。2、含药血清制备技术的规范化研究。3、血清药理方法体外反应体系确定的规范化技术研究。为采用中药血清药理方法开展研究提出初步技术规范。一.建立中药含药血清体外药理实验方法意义的论证（一）含药血清和原药液体外试验的比较研究用原药液和用含药血清在体外实验中取得的比较研究发现，有的结果一致，有的结果不一致。如桂枝汤原药液及含桂枝汤血清均有明显抑制HSV-1病毒增殖作用；血府逐瘀浓缩丸原药液及其兔含药血清对家兔主动脉SMC勺DN始成均有明显抑制作用。用原药液和用含药血清在体外实验中亦可见不相一致结果，如当归补血

17、汤对小鼠肝过氧化脂质的生成具有明显的抑制作用，而当归补血汤水煎液对小鼠肝过氧化脂质生成则呈现明显的促进作用；当归补血汤原药液体外对小鼠NK细胞无激活作用，含药血清及整体实验均有激活作用；桂枝汤原药液在体外无直接抑制副流感病毒致细胞病变的作用，而给药后2小时采集的含桂枝汤家兔血清则有明显抑制作用。用原药液和用含药血清所得结果的不一致，究竟何种结果更接近整体动物实验和临床实际，这需要积累更多的对比性实验结果予以澄清。但从上述实验结果分析，用含药血清所得的结果似更符合中医传统的认识和临床或整体动物实验的结果。（二）含药血清和整体给药药效相关性研究含药血清的体外药理实验结果与该中药给予动物所得得整体药

18、效反应是否具有相关性，是评价含药血清体外实验技术现实应用性的关键。研究结果提示：（1）在相应药效指标上，用含药血清所得的体外实验结果与该药口饲后所得的结果具有相似性。（2）用含药血清体外实验与整体口饲给药，对特定药理指标进行量效和时效的对比，发现二者在药效动力学上有良好的相关性。（3）用含药血清给予模型动物可以呈现该药口饲模型动物的相同药效。（三）含药血清药效和临床疗效相关性研究用血府逐瘀丸含药血清进行体外实验和用血府逐瘀丸进行临床治疗前后相关指标观察，二者在抑制血小板粘附聚集性及增加红细胞变形性方面的作用基本一致，也即用含药血清进行体外实验所反映的结果基本和临床疗效相吻合。二.含药血清制备技

19、术的规范化研究（一）采血时间的确定药物灌胃给动物后，血药浓度呈现由低到高、由高到低的时量过程，何时采血，是含药血清制备技术中至关重要的一步，直接影响药效的呈现。采血时间过早过晚，不仅不能很好的反映药效，而且也与方便实验操作有关。因此，通过实验摸索出一个较为准确而易行的采血时间是含药血清制备技术中的重要一环。经典方法建议，方剂给药后可设定4-5个时间点采血，观察药效的时效过程，选择药效峰值时作为以后实验的采血时间。另一方面，许多研究显示，虽然不同方剂药效具有各自不同的时效过程，但药效峰值一般在给药后0.5-4h之间；各实验中，给药后1-2小时采集的含药血清均反应出药效。也可以连续5个半衰期给药达

20、到稳态血药浓度后采血。（二）口饲给药剂量的确定实验显示，以相当于临床等效剂量的0.8-10倍口饲给动物0.5-2小时所采集的含药血清，在体外进行相应实验，能呈现药理作用。或者遵照新药药效学试验动物给药剂量计算方法确定给药剂量。含药血清的剂量表述也是一个值得探讨的问题，这里涉及血清供体动物的口饲给药量以及体外试验时的含药血清稀释后终浓度量。为了更确切的表示剂量，在叙述结果时，应说明供体动物的口饲给药剂量以及体外试验时含药血清的终浓度或稀释倍数，并以g生药/kg体重/U表示剂量（如以含桂枝汤的大鼠血清对HSV-1病毒的作用实验为例：动物口饲给药量为10g生药/kg体重，实验时所用含药血清的终浓度为

21、1:12稀释，则含药血清的剂量为10/12=0.83g生药/kg体重/U，这里U表示是血清在体外系统中终浓度时的稀释倍数。（三）给药次数、给药天数对药效的影响重复给药是临床常用的治疗方法，给药次数、给药天数与含药血清的药效有关。确定一个有效而又简单易行的给药方案，有利于血清药理学的推广和应用。研究显示，同一剂量一次给药优于分次给药，同一剂量多次给药优于单次给药，多日给药优于一日给药。分析比较多项实验结果，参照中医临床用药习惯，现代药理学中关于血药浓度和现有药动学中半衰期数值的实际，为了方便多次给药后含药血清的采集，可每日给药二次，连续二天，第三天上午给药后1-2小时采血，以便获得药效作用强的含

22、药血清。（四）采血部位对含药血清药效的影响选择适当的采血部位是为了最大限度、最方便地获得含药血清，从一些对比实验看，分别从动脉、静脉采血对药效似无明显影响。如果药效物质利用、代谢速度快的从动静脉中采集的血清，在药效上可能会有所差异，由此，能否给我们对药物作用维持时间的认识有所启示。另外，从门静脉和肝静脉分别采集含药血清，比较他们的活性，能否也可给我们就肝脏对该药物代谢的影响有所启？这些是含药血清应用研究上应进一步进行的工作。（五）动物种属的差异性通过对大鼠、小鼠、兔、犬、豚鼠及正常人血清及含药血清对不同反应体系作用的结果显示，不同种属动物血清在不同实验体系寻求合适的血清添加量（指含药血清在反应

23、体系中的终浓度）对正确判断实验结果是不可忽视的因素之一，应在预实验中予于探讨。一般来说，提供含药血清的动物种属与提供反应体系的动物种属越接近，血清的添加量越大。（六）供血的实验动物数采集含药血清所需动物数应遵循动物实验的一般原则，如大鼠、小鼠或豚鼠每组动物数应不少于10只，家兔应不少于8只，以避免动物个体差异所致不均匀性。可以一个动物一份血清，做个体含药血清药效测定，亦可将同组个体血清混合后作为一个样本使用。（七）含药血清的保存含药血清经低温保存后是否对药效产生影响与所观察的药效指标和药物本身有效成分的稳定性有关。如抗病毒实验，血清可在4保存5天或-20保存二月，药效不受影响；在一些生化反应体

24、系中，含药血清-20保存二月后，有的对药效无明显影响，有的对药效能产生明显影响，因此以采用新鲜血清为好。含药血清药理方法体外反应体系确定的规范化技术（一）严格执行正常血清对照含药血清中除药物的成分、药物的代谢产物和药物引起的反应产物外，还有血清中固有的生物活性成分和其他的干扰因素，能对体外系统起作用。为排除干扰，应在实验时设正常血清对照组。正常血清可在给药前采集或另设一组动物采集，含药血清的作用强度，应与正常血清比较而确定。（二）反应体系中含药血清添加量（即反应体系中含药血清的终浓度）含药血清在体外实验系统中，一般常和反应液或培养液共同培育。由于种系不同，正常血清对反应对象（细胞、酶等）会产生

25、程度不同的影响，就需要有合适的血清添加量。一般而言，在一定范围内含药血清的添加量与药效物质的含量成正比。与药效强度成正比。但达到足够添加量后，继续增加含药血清用量，或引起药效强度的降低或引起反应系统损伤。从现有研究结果可见，反应体系中含药血清终浓度一般在20%或以下较宜。增加口饲给药剂量后，含药血清的添加量应相应减少。（三）血清冻干技术的应用为了增加血清的添加量以更好的反映药效，可将含药血清制成冻干粉，使用时以维持液溶化。含药血清制成冻干粉后可显著增加反应体系中血清添加量。（四）含药血清的灭活正常血清中含有大量生物活性物质，它们在含药血清的反应体系是否产生干扰，血清经5630min灭活后是否可

26、排除这些干扰，而且在排除干扰的同时对药效有否影响，值得关注。研究结果提示，血清灭活后对药效的影响与选择的反应体系及正常血清是否含有相关的活性物质有关。在目前一些生化反应体系中，血清对药效似未产生显著影响。在细胞培养的抗病毒实验中，由于正常血清中含有补体等生物活性物质，可以较强干扰细胞和病毒的生长和繁殖，灭活后使这些作用下降约50%；含药血清中既有上述的生物活性物质又有药物的有效成分，灭活后排除了正常血清中的生物活性物质，虽然使药物作用强度下降，但可体现药物本身作用，因此，在体外进行抗病毒实验时应采用灭活血清。（五）预处理方法对血清活性的影响有些体外实验和分析研究中需要去除血清中的蛋白，但血液中

27、的药物成分一部分是与血浆蛋白结合而存在，去蛋白的不同预处理后对药效产生何种影响值得关注。以抗Ach收缩支气管平滑肌为例，可见正常血清经乙醇、丙酮、甲壳素处理去蛋白后，显著降低其作用，而5630分钟使蛋白变性则无明显影响。也有研究发现，含小青龙汤血清经丙酮处理后对支气管平滑肌抗His和Ach的抑制无明显影响。血清去蛋白后，对特定的生理生化、效能指标产生不同的影响，其重要因素是这些生物活性物质和药效物质同血清蛋白的结合能力。我们似乎有可能用含药血清去蛋白前后药效的变化，来估算有效成分不单一、不清楚的中药复方药效成分的蛋白结合率。含药血清药理的应用研究一.含药血清药物动力学研究已有的实验工作表明，中

28、药复方含有多种有效成分，用通常的检测某一种成分的血药浓度经时变化，不能代表全方的药代动力学参数，多个成分之间还会发生相互影响。用含药血清研究他们对药效的经时变化，有可能对我们了解中药复方作用的动力学过程，指导临床给药方案，了解中药复方的作用特点有所裨益。通过当归补血汤和大川芎丸含药血清对不同药效的动力学研究过程可发现，同一复方不同药效间的效应消除半衰期数值比较接近，效应达峰时间彼此间有相当差异。已知消除半衰期是动力学参数中重要的数值，对制定给药方案有很大影响，是否有可能通过对该方某一药效的效应半衰期的估测，大体可作为确定给药方案的参考；达峰时间的差异，如与血清药物化学相结合，能否作为研究确定不

29、同药效活性成分的参考，也是以后值得研究的内容。此外，目前在中药复方药物动力学研究中，还常采用以整体动物药理效应为测试指标的药理效应法和以整体动物毒理效应为测试指标的药物累积法。但以中药血清药理方法研究中药复方药物动力学有以下特点：1.由于采用体外实验方法，可以进行大量的药理效应试验观察，较整体动物易于控制。2.同一批试验，分离出的含药血清可以进行多项药理效应试验指标观察，求出多个药理效应的药动学参数。3.如同步检测含药血清中的某一成分的血药浓度，可以分析它与哪一项药理效应指标有关联。需要注意的是，在时间一效应实验中所用剂量过小或过大，可能会干扰药动学参数的测定，加之药理效应法较血药浓度法测定误差大，建议采用35种有效剂量（其中一种相当于临床等效剂量）平行地进行时效测定与比较。二.中药血清药化学研究“中药血清药化学”和“中药血清药理学”是80年代末由日本学者田代真一同时提出的，但发展速度较后者缓慢。除可见沿用传统经典的血药浓度测定外，尚无独具特征的研究新方法和思路。有人提出以构建血清指纹图方法来开展研究，但相关具体研究报道较少。由于含药血清中的化学成分与含药血清的药理效应密切相关，因而中药血清药化学与中药血清药理协同研究，可能有助于研究的开展和深入