基因工程归纳

1、TA克隆TA克隆是利用绝大多数的TaqE在扩增产物的3端加上一个不依赖模板（1分）的脱氧腺嘌呤核苷酸（A），然后与具有突出T尾巴的载体即T-载体连接克隆。人工染色体克隆载体是一种“穿梭”克隆载体，即该载体含有质粒克隆载体所必备的第一受体的质粒复制起始位点（Ori），同时含有第二受体染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列以及合适的选择标记基因。基因工程在细胞外把目的核酸分子与载体核酸分子组合成新的遗传物质，再把它导入原本没有这种物质的细胞内，并使这种重组遗传物质在细胞内的无性繁殖获得成功，这一工作内容被定义为基因工程。基因文库通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA保存于适当宿主菌或噬菌

2、体中形成的转化子群，所有重组DNA序列的总和代表该基因组的DNA全序列。基因芯片是在固体支持物上高密度排列的DNA片段或寡核苷酸。通过与被检测的核酸序列互补配对，从而探知检测对象的存在和数量。原位菌落杂交根据微孔滤膜杂交和原位杂交的原理而改良的一种筛选重组体的一种核酸杂交方法。它是将生长在或影印在微孔滤膜上的菌落(或噬菌斑)原位溶菌，原位进行DNA变性并原位固定在滤膜上，然后用放射性标记的探针同固定了的DNA进行杂交经放射自显影后，确定哪一个菌落含有重组的DNA分子，再从参比平板上选取重组体。定向克隆是指使目的基因按一定方向插入载体。最常用的方案是：用两种限制性核酸内切酶切割载体和目的基因，从

3、而在载体和目的基因两端产生不同的两个黏末端。定向克隆有效地限制了载体地自身环化，并且实现了目的基因的定向插入。噬菌粒载体一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。它们既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点，可以按正常的双链质粒DNA分子形式复制，形成的双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒特性。当存在辅助噬菌体时，又可进行滚环复制产生单链的DNA，并包装成噬菌体颗粒被挤压出细胞。衔接物衔接物是一种人工合成的具有一个或多个限制性内切酶识别位点的寡聚核苷酸片段。同裂酶是指来源不同但具有相同识别序列的一类限制酶。基因沉默导入并整合到受体细胞核基因组上的外源基因，在当代或后代转基因个

4、体中表达活性受到抑制的现象。亚克隆将初级克隆中的插入片段“摘出”，连接到另外一个载体中的操作过程称为亚克隆。基因沉默导入并整合到受体细胞核基因组上的外源基因，在当代或后代转基因个体中表达活性受到抑制的现象。噬菌粒载体一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。它们既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点，可以按正常的双链质粒DNA分子形式复制，形成的双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒特性。当存在辅助噬菌体时，又可进行滚环复制产生单链的DNA，并包装成噬菌体颗粒被挤压出细胞。大肠杆菌DNA聚合酶I具有哪几种酶活性5-3外切酶活性，3-5外切酶活性，5-3聚合酶活性。将外源基因导

5、入细胞有借助生物载体的转化、转染、转导和借助物理化学等手段直接导入，三种直接导入的方法：显微注射法，电激法，基因枪法。请简述原核生物mRNA的特征半衰期短；多顺反子形式；存在SD序列. cDNA克隆和基因组克隆有何不同基因组克隆包含不在cDNA中出现的5端调控序列和内含子什么叫质粒的迁移当细胞内共存接合型质粒和非接合性质粒时，由接合型质粒引发的非接合型质粒的被动转移过程某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因可能是由于高浓度的酶，高浓度的甘油，低离子强度，或以锰离子取代镁离子，以及高pH。在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cD

6、NA而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子细菌是原核生物，没有内含子剪接系统，cDNA是通过逆转录酶的作用，由成熟的mRNA产生的，因此cDNA只含有外显子，不含内含子。细菌不能识别真核生物的启动子简述基因克隆载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件Northern印迹与Southern印迹有什么不同转移的对象不同，Northern印迹是将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上的过程。虽然RNA电泳前不需像DNA那样进行酶切，但也需要变性。不过变性方法是不同的，它不能用碱变性，因为碱变性会导致RNA

7、的降解怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I限制位点中去化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中（或者用接头分子）请简述基因克隆载体必须具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点;具有较高的外源DNA的载装能力;具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点及合适的筛选标记;具有安全性，不能随意转移，避免基因的非控制性扩散1、什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素

8、影响?在实验中出现星号活性会导致什么不利影响？（10分）在“非最适”反应条件下，（2分）有些限制性核酸内切酶识别序列的特异性会发生松动，不再严格遵循识别序列准确切割DNA分子。（2分）这种特殊的识别能力叫做星号活性。 概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5, vv) （1分）； (2)限制性内切核酸酶用量过高(>100UugDNA)；（1分）(3)低离子强度(<25 mmolL)；（1分）(4)高pH(80以上)；（1分）(5)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等) （1分）。不利影响是出现非特异DNA片段，甚至不能获

9、得预期DNA片段，影响进一步的重组。（1分）2、某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因内有一Bgl I的切点。现用Bgl I切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体? （10分） (1)加四环素；（3分）(2)Tetr Kans和Tetr Kanr；（3分）(3)重新点种在含Tet、Kan和只加Tet的平板上，选择只在Tet平板上生长的菌落，即为所需的重组体。（4分）3、PCR的基本原理是什么?用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息? （5分）(1

10、)DNA半保留复制的原理（2分），在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸（1分）。 (2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列（2分，答到引物给1分）。Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。什么是蓝白斑筛选法? 蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性? 这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在l载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌b半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段的l载体转入lac的宿主菌后，在含有5溴4氯3引哚bD半乳糖苷

11、(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力，转入lac-宿主菌后，在含有5溴4氯3引哚bD半乳糖苷 (X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。 b半乳糖苷酶的N末端是非必需的，可以进行修饰，并不影响酶的活性或a肽的互补性。如果插入的外源DNA引起a肽的可读框的改变，或者插入片段在正确的可读框中含有终止密码的话，就会形成白色噬菌斑。如果插入DNA的碱基数正好是3的倍数，或者插入的DNA中不含有终止密码的话，仍然会形成蓝色噬菌斑。这种插入物的长度可达几百个碱基对。M13载体的这种性质可以用

12、来检测和选择产生新的终止密码或改变可读框，即移码突变。请说出基因工程的主要步骤从现有的生物有机体基因组中，利用酶切消化或PCR扩增等方法，获得带有目的基因的DNA片段；在体外将带有目的基因的外源DNA片段连接到具有选择标记的载体分子上，能够形成自主复制的重组分子；将重组DNA分子转移到适宜的受体细胞，并使其一起增殖；从大量的细胞繁殖群体中筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆；从筛选出来的受体细胞克隆中提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；将分离到的目的基因克隆到表达载体上，导入受体细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。2、为了绘制3.0kbBamHI

13、限制性片段的限制性图谱，分别用EcoRI、HpaII、EcoRI+HpaII消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴化乙锭染色后观察DNA带型，EcoRI消化得到大小分别为1.7kb、0.9kb、0.4kb的三条片段，HpaII消化得到大小为1.6kb和1.4kb的两条片段，EcoRI+HpaII双酶切消化，得到4条DNA片段，大小分别为1.2kb、0.9kb、0.5kb和0.4kb。请根据这些结果，绘制一个限制性图谱，要标明EcoRI和HpaII识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离（kb）。（10分）BamHI位点每个1分，标对其他位点及距离8份。若判断为环形分子，不给

14、分，如果既有正确地图谱，又有错误图谱，扣2分。3、什么是同聚物加尾连接法(homopolymer tails joining)?用何种方法加尾?具有哪些优缺点? （10分）所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dA(dG)和dT(dC),然后在DNA连接酶的作用下涟接成为重组的DNA。这种方法的核心是利用末端转移酶的功能，将核苷酸转移到双链DNA分子的突出或隐蔽的3'-OH上。以Mg2+作为辅助因子，该酶可以在突出的3'-OH端逐个添加单核苷酸，如果用Co2+

15、作辅助因子则可在隐蔽的或平末端的3'-OH端逐个添加单个核苷酸（4分）。 同聚物加尾法实际上是一种人工黏性末端连接法，具有很多优点： (1)首先不易自身环化，这是因为同一种DNA的两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化（2分）。(2)因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高（2分）。(3)用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接。同聚物加尾法也有一些不便之处：(1)方法繁琐；(2)外源片段难以回收。由于添加了许多同聚物的尾巴，可能会影响外源基因的表达。另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端连接法一样，重组连接后往往会产生某种限制性内切核酸酶的切点（2分）。1、请简述基因克隆载体必须具备的条具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）（3分）具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 （3