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1、正交设计研究石韦总黄酮和鞣质提取工艺(一) 作者:王自军,杨红兵,齐誉,边丽【关键词】 石韦;,总黄酮;,鞣质摘要:目的优化石韦总黄酮和鞣质的超声提取工艺。方法以总黄酮和鞣质含量为考察指标,通过正交设计试验筛选石韦总黄酮和鞣质的最佳超声提取工艺。结果总黄酮的最佳提取条件为A1B3C2D2,即(乙醇)=60%,m(乙醇)m(石韦)=201,提取时间60 min,共提取2次,测得石韦中总黄酮的平均含量为3.768%;鞣质的最佳提取条件为A1B3C2D1,即(乙醇)=10%, m(乙醇)m(石韦)=201,提取时间30 min,提取1次,测得石韦鞣质平均
2、含量为6.266%。结论 通过正交设计实验优选得到的石韦总黄酮和鞣质的超声提取工艺条件稳定可行。关键词:石韦; 总黄酮; 鞣质Study of Ethanol Extraction Process for Total Flavonoids And Tannin Containment of Flolium Pyrrosiae by Orthogonal DesignAbstract:ObjectiveTo optimize ultrasonic extracting process of the total flavonoids of and tannin Flolium pyrrosiae
3、with orthogonal design. MethodsThe optimum ultrasonic extraction conditions were investigated by orthogonal design and with the total flavonoids and tannin as the content index. ResultsThe optimum extraction condition of the total flavonoids obtained was: A1B3C2D2,(CH3CH2OH)=60%,m(CH3CH2OH)m(Flolium
4、 pyrrosiae)=201,the time of extracting was 60 minutes, the total times of extraction was 2, the average containment flavonoids of Flolium Pyrrosiae was 3.768% ;the optimum extraction condition of tannin obtained was: A1B3C2D1,(CH3CH2OH)=10%,m(CH3CH2OH)m(Flolium pyrrosiae)=201,the time of extraction
5、was 60 minutes,the total time of extraction was 1, the average containment tannin of Flolium Pyrrosiae was 6.266%. ConclusionThe optimized process is feasible for the extraction of the total flavonoids of Flolium Pyrrosiae and tannin. Key words:Flolium Pyrrosiae; Total flavonoids; Tannin石韦系水龙骨科石韦属植物
6、的全草,主要分布于华北、西北及湖南等地。石韦味苦、甘、性微寒,归肺,膀胱经。具有利尿通淋、清热止血的功效。主治肺炎水肿、膀胱炎、泌尿系统结石、慢性气管炎、吐血、尿道炎、感冒咳嗽及小便不利等。药理研究表明庐山石韦水煎浓缩液及提取物经动物实验均有镇咳及祛痰作用,对于因化学疗法及放射疗法引起的白细胞下降,有使其升高作用,并有抗单纯性疱疹病毒作用1。石韦含有多种生物活性物质,对它的研究很少,尤其是对总黄酮和鞣质提取工艺的研究尚未见报道。超声技术的应用近年来得到很大发展。超声具有穿透力强、选择性高等特点。超声技术可以大大加快反应速度,缩短反应时间 2。超声技术应用于植物细胞破壁,有效地提高了收率3。本实
7、验运用超声技术辅助研究石韦中总黄酮和鞣质的提取工艺,反应速度加快。1 材料和方法1.1 仪器和材料UV2401型分光光度计(日本岛津),超声波仪 (浙江省象山县石浦海天电子仪器厂),BS210S型万分之一电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);SHBB95型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司),HHS数显恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)。石韦(石韦粉碎备用)、95%的酒精、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、EDTA、铬黑T、醋酸锌、浓氨水(试剂为分析纯)。1.2 方法1.2.1 原理乙醇是常用的黄酮类化合物提取溶剂,利用黄酮类分子中的酚羟基可与Al3+在碱性溶液中显色的原理测定其含量4
8、;鞣质为多羟基物,具有较强极性,不稳定的特点,故在提取时选用极性较大溶剂、短时间提取的方法,本实验选取的是一定浓度的乙醇溶液,采用超声提取法,最后用络合滴定法测其含量,计算公式为鞣质%= 0.1556×(V1×C1-20×V2×C2) W×100%5。在正交设计研究石韦总黄酮和鞣质的提取工艺实验中6,总黄酮和鞣质采用的是超声提取法。用比色法测定黄酮含量,络合滴定法测定鞣质含量,最后运用数理统计方法处理实验数据 ,最终找出最佳提取条件。1.2.2 标准曲线的绘制精密称取120干燥至恒重的芦丁对照品10 mg置烧杯中,加适量乙醇在水浴上微热溶解,放
9、冷后转移到50 ml容量瓶中,加乙醇稀释至刻度,摇匀(每毫升含芦丁0.2 mg),精密吸取标准溶液0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 ml于25 ml容量瓶中,分别加水至6 ml,分别加入5%亚硝酸钠1.0 ml混匀,放置6 min,然后加入10%硝酸铝1.0 ml,混匀,放置6 min,加入4%氢氧化钠10.0 ml,用水稀释至刻度,混匀,放置15 min,在510 nm处以第1瓶溶液作空白分别测定吸光度,绘制标准曲线,建立回归方程A=11.225C+0.0027,r=0.999 13。1.2.3 从石韦中提取总黄酮精密称取一定量的石韦,按因素水平表超声提取石韦中的总黄酮
10、,减压过滤,用100 ml的容量瓶定容。摇匀,放置5 min。吸取0.5 ml移至10 ml容量瓶中,分别加入5%亚硝酸钠0.4 ml,放置6 min后,加10%硝酸铝0.4 ml,放置6 min后,再加4%的氢氧化钠4 ml加水至刻度,摇匀,放置15 min;在波长510 nm处,进行吸光度的测定,最后处理数据。1.2.4 从石韦中提取鞣质精密称取一定量的石韦,按因素水平表超声提取鞣质,减压过滤,将提取液恒温水浴15 min后,加入25 ml醋酸锌溶液,18 ml浓氨水,再恒温水浴30 min。取出冷却至室温,用一定浓度乙醇溶液在500 ml容量瓶中定容,静置10 min,精密吸取上层清液2
11、5 ml于250 ml锥形瓶中,加蒸馏水200 ml,量取25 ml氨氯化铵缓冲溶液(pH=10),加少许铬黑T(固体),以0.05 mol?L-1EDTA滴定,记下EDTA溶液体积,最后处理数据。2 结果2.1 提取黄酮正交实验数据处理与分析见表12。表1 因素水平(略)表2 正交实验结果分析(略)由表2中极差可知,各因素依次为BACD,以A1B3C2D2为最佳。2.1.2 提取鞣质正交实验数据处理与分析见表34。表3 因素水平(略)表4 正交实验结果分析(略)由表4中极差分析可知,各因素依次为ABCD,以A1B3C2D1最佳。3 讨论研究表明,黄酮类化合物具有降脂、抗血栓、抗氧化、降糖等多
12、种生理活性7。鞣质广泛存在于自然界,是多种中草药的有效成分之一,具有多种生物活性,如抗肿瘤、抗过敏、抗衰老等,鞣质类药物的研制引起了国内外学者广泛的关注8。本文根据正交设计实验采用超声技术从石韦中提取总黄酮,其优选的最佳工艺条件为:乙醇浓度为60%,乙醇与石韦的质量比为201,提取时间60 min,共提取2次,测得石韦中总黄酮平均含量为3.768%;从石韦中提取鞣质优选的最佳工艺条件为:乙醇浓度10%,乙醇与石韦的质量比为201,提取时间30 min,提取1次,测得石韦鞣质平均含量为6.266%。石韦提取工艺条件的筛选,其评价指标的选择十分关键。仅仅用鞣质和总黄酮得率评价工艺条件尚不完全,有待进一步研究。参考文献:1 马 辰,周 圆,刘爱茹.高效液相色谱法测定中药石韦两种成分的含量J.药学学报,2003,38(4):286.2 应崇福.超声学M.北京:科学出版社,1990:511.3 赵兵,王玉春,欧阳藩,等.超声波在植物提取中的应用J.中草药,1999,30(9):458. 4 孙佩霞,叶丽卡,张晓丽,等.比色法测定淫羊藿胶囊中总黄酮的含量J.沈阳药科大学学报,1999,16(1):
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