乙醇对小鼠原代培养肝细胞损伤及黄芩茎叶总黄酮保护作用的实验研

1、乙醇对小鼠原代培养肝细胞损伤及黄芩茎叶总黄酮保护作用的实验研究         08-05-26 15:21:00     编辑：studa20                   作者：李素婷，杨鹤梅，周晓慧【关键词】  乙醇；,肝细胞；,原代培养；,黄芩茎叶总黄酮；,保护作用摘要：目的

2、研究黄芩茎叶总黄酮（SSTF）对乙醇损伤小鼠原代培养肝细胞的保护作用。方法采用胰蛋白酶消化、分离小鼠肝细胞进行原代培养，乙醇体外诱导肝细胞损伤，以不同浓度的SSTF对肝细胞保护，检测培养液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性和肝细胞内丙二醛（MDA）含量，MTT法测肝细胞存活率。结果SSTF（100，200，300 mgL-1）明显改善肝细胞存活率，抑制乙醇引起的ALT活性的升高，对肝细胞中MDA含量的升高有明显的抑制作用。结论SSTF对乙醇损伤的小鼠肝细胞有明显的保护作用，其机制可能与SSTF的抗氧化作用有关。关键词：乙醇；  肝细胞；  原代培养；  黄芩茎叶总黄

3、酮；  保护作用The Protective Effect of Total Flavonoid in  scutellaria baicalensis Stem-Leaf on Primary Cultured Mice Hepatocytes Injured by Ethanol  Abstract：ObjectiveTo study the protective effect of total flavonoid in Scutellaria baicalensis stem-leaf (SSTF) on primary mice  hepatoc

4、yes  injured by ethanol. MethodsPrimary  hepatocytes were isolated, cultured  by trypsin digestion and induced by ethanol. Various concentrations of SSTF were added to the primary cultured hepatocytes  for 12h.The content of malondialdehyde(MDA) in hepatocytes and the activity of

5、 ALT in cultural supernatant were determined by general methods,the viabilities of hepatocytes were measured by MTT.ResultsThe elevation  of  MDA content of hepatocytes and ALT level in supermatant of cultural hepatocyes were restored remarkably by SSTF, hepatocytes viability was improved

6、significantly by SSTF.ConclusionSSTF has a protective action on primary mice  hepatocyes  injured by ethanol.This might be associated with its anti-lopoperoridation.Key words：Ethanol;  Hepatocytes;  Primary cultured;  SSTF;  Protective effect     肝脏是酒精代谢的

7、主要脏器，过量饮酒可造成肝脏不同程度的损害，并进一步发展为脂肪肝、肝纤维化和肝硬化，严重危害人类健康。了解酒精性肝损伤的发病机制，筛选有效预防和治疗的药物应用于临床，是当前面临的重要课题。黄芩茎叶总黄酮(SSTF)是我院中药所对黄芩的茎叶部分提取的有效成分，整体实验已证实其对肝损伤有保护作用1。本文建立体外乙醇性肝细胞损伤模型，在细胞水平上进一步研究乙醇性肝损伤的机制及SSTF对肝细胞保护作用机制。1  材料与方法1.1  药品与试剂SSTF（含总黄酮73%）：承德医学院中药研究所提供，临用前以蒸馏水配制，用饱和碳酸氢钠调pH=7.6；Hanks液高压灭菌,4保存；0.8

8、gL-1胰蛋白酶：用Hanks液溶解，过滤除菌，调pH 7.2，分装,-30保存；基础培养液：RPMI 1 640培养基10.0 g,用超净水900 ml溶解,5.6%NaHCO3调pH至7.2，定溶到1 000 ml,过滤除菌，临用前每80 ml,加入新生小牛血清20 ml,青霉素100 uml-1,链霉素100 gml-1,胰岛素5 gml-1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA测定试剂盒:南京建成生物工程研究所。1.2  动物昆明种小鼠，13 d龄乳鼠，雌雄不限，清洁级，承德医学院实验动物管理中心提供。1.3  仪器CO2培养箱（Taibai LNA-122D 日

9、本），MD-100半自动生化分析仪（美国Bayer公司），721W微机型分光光度计（上海光学仪器五厂），离心机（TGL.16G 上海）。1.4  肝细胞分离培养2取新生小鼠30只，断头放血，无菌分离肝脏，置Hanks液中，灌注冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成1 mm3左右的组织块，用Hanks冲洗数次，除去血细胞，加入0.8 gL-1胰蛋白酶10 ml,37孵育12 min，加入数滴血清终止消化，用滴管轻吹打成细胞悬液，经200尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，1000 r/min离心5 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>85%，按1 ×109个L-1，接种于铺有鼠尾胶原

10、的24孔和96孔板中，37，5%CO2条件下培养。1.5  乙醇诱导肝细胞损伤模型的建立将含肝细胞培养液的96孔板培养24 h更换培养液，设正常对照组，25，50，75，100 mmolL-1四个乙醇组，肝细胞悬液与不同浓度乙醇继续培养12 h，取培养液按赖氏法测定ALT活性，TBA法检测MDA含量,MTT法测定肝细胞存活率。1.6  SSTF对诱导肝细胞损伤的作用取上述培养24 h肝细胞，设乙醇损伤模型组、SSTF(100，200，300 mgL-1)3个剂量保护组、正常对照组，每组设8个复孔。模型组和SSTF组加入乙醇100 mmolL-1，同时SSTF组加入不同浓度的SSTF，正常对照组加不含血清的培养液，继续培养12 h，收集培养上清液检测ALT活性和MDA含量，MTT法测定肝细胞的存活率。1.7  统计学处理数据以±s表示，用SPSS11.5计算机软件进行统计学分析, 组间比较采用t检验，P<0.05，有统计学意义。2  结果2.