低频重复经颅磁刺激对帕金森病大鼠行为学的影响

1、    低频重复经颅磁刺激对帕金森病大鼠行为学的影响作者：孙秀巧 王彦永 王铭维 孙海民 郭记宏 时军 王培芝    作者单位：050031 石家庄,河北医科大学第一医院神经内科/河北省脑老化与认知神经科学重点实验室【摘要】  目的 探讨0.5 Hz重复经颅磁刺激(rTMS)对帕金森病大鼠行为学的影响。方法 取健康SD大鼠45只，用6OHDA毁损右侧黑质致密部(SNc)与中脑腹侧背盖(VTA)制备偏侧帕金森病模型。用阿扑吗啡(APO)腹腔注射筛选，将成功的20只帕金森病鼠随机分为治疗组和对照组，每组10只。治疗组给

2、予rTMS治疗，频率为0.5 Hz，刺激强度为阈上30%，连续20个刺激，每天1次，连续刺激2周。对照组予以假刺激。在治疗前、治疗结束后第1天、14天、28天分别测定APO诱导的大鼠旋转圈数、启动潜伏期的变化。结果 (1)大鼠旋转圈数(r/min)：治疗组与对照组在治疗结束后第14天为(9.7±3.0 vs 14.6±2.6)、28天为(9.2±2.7 vs 14.2± 2.6)，治疗组旋转圈数减少，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组在治疗结束后第14天、28天与治疗前比较差异有统计学意义(P<0.05)；对照组各时间点比较

3、差异无统计学意义(P0.05)。(2)启动潜伏期(s):治疗组与对照组rTMS治疗结束后第1天(25±9 vs 39±16)、第14天(18±7 vs 42±16)、第28天(17±7 vs 42±16)比较，治疗组启动潜伏期明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05);治疗组各时间点与治疗前比较差异有统计学意义(P<0.05)；对照组各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 0.5 Hz、阈上30%刺激强度的rTMS可改善PD大鼠的行为学异常。【关键词】  帕金森病 磁疗法 行为学 大鼠磁刺激(m

4、agnetic stimulation，MS)是一种无痛、无创、快捷的神经电生理技术，可以影响中枢及外周神经的功能活动，并且可以通过调节频率、强度、刺激间歇及持续时间来影响神经系统的兴奋性，因而对中枢及外周神经系统疾病具有潜在治疗作用。重复经颅磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation,rTMS)对帕金森病(Parkinsons disease,PD)的疗效目前尚无一致结论。为此，本实验利用健康SD大鼠建立6羟基多巴胺(6OHDA)偏侧PD模型。应用rTMS技术对模型大鼠进行干预，观察rTMS对PD的治疗作用。  

5、60; 1  材料与方法    1.1  材料    1.1.1  实验动物： 健康SpragueDawley(SD)雄性大鼠45只，体质量270300 g，鼠龄34个月。由河北医科大学实验动物中心提供。    1.1.2  主要试剂与仪器： SR6N脑立体定向仪(日本)、肌电/诱发电位仪、Magstim220型磁刺激仪和S90型圆形线圈(英国牛津公司)、5 l无存液微量进样器(上海安亭微量进样器厂)；6羟基多巴胺(6OHDA)、阿朴吗啡(Sigma公司)。

6、0;   1.2  检测方法    1.2.1  模型的制备及筛选: 将45只雄性SD大鼠按改良的Thomas1方法制作PD大鼠模型，10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉。参照文献2确定右侧黑质致密部(SNc)、中脑腹侧被盖部(VTA)坐标位置。用5 l微量注射器抽取4 g/l的6OHDA(溶于0.2%维生素C的生理盐水中)，每个点注射2 l。于术后1周、2周进行行为检测，应用阿朴吗啡(apomorphine,APO)腹腔注射(0.5 mg/kg)，观察大鼠旋转行为变化，观测时间为1 h/次。规定大鼠恒定转向左

7、侧,身体环曲，首尾相接，360度为一转(r)，且旋转圈数>210 r/30 min,为成功PD大鼠模型,否则予以淘汰。将造模成功的PD大鼠20只随机分为对照组、治疗组各10只。    1.2.2  干预方法： 治疗组给予rTMS治疗，对照组予以假刺激。首先检测静息皮质阈值(relaxed threshold,RT)：用水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠，麻醉深度掌握在轻刺激尾部鼠有轻微活动。使用Magstim 220型磁刺激仪和S90型圆形线圈，最大输出磁场强度2.0 Tesla。线圈放在大脑半球，用同心圆针电极在下肢腓肠肌肌腹记录对

8、侧头部刺激的诱发电位，单极针电极置于鼠尾作为接地电极。首先给予阈上强度刺激,记录到波形、潜伏期基本恒定的运动诱发电位(MEP)后逐渐降低刺激强度,连续5次刺激至少引出3个峰峰波幅0.2 mV的最小刺激强度定为安静状态时的后肢RT3。将清醒的PD大鼠置于一长圆形器具中,头部暴露，刺激部位为引出RT的位置。将线圈紧贴大鼠的前脑部皮肤进行阈上30%刺激(实际刺激强度为最大输出强度的40%60%)，刺激频率为0.5 Hz，连续20个刺激，每天治疗1次，连续刺激2周。    1.3  效果评价  在治疗前、治疗结束后第1天、14天、28天分别测定APO诱

9、导的旋转圈数、启动潜伏期的变化。    1.3.1  旋转圈数检测： 应用APO腹腔注射(0.5 mg/kg)，计数开始旋转后0.5h内的旋转圈数，以每分钟的旋转圈数进行统计学分析。    1.3.2  启动潜伏期的检测： 采用僵住实验，测试装置为一垂直的栅栏，高44 cm，宽55 cm，每两个水平横杆间距为1 cm。测试时将大鼠放于栅栏之上，使其四爪均抓住横杆，当大鼠抓牢后开始计时，大鼠左前爪子开始移动时停止计时，此时的时间称为启动潜伏期，以秒(s)为计数单位，每只鼠均测试5次，每次间隔5 min，取平均值进行统

10、计学分析。    1.4  统计学处理  采用SPSS 11.5软件进行统计分析。计数资料以±s表示，不同时间比较采用配对t检验，组间比较采用t检验；启动潜伏期2组间同一时间点比较因不符合正态分布，经均衡检验后采用符号秩和检验(wilcoxon配对法),P<0.05为差异有统计学意义。    2  结  果    2.1  APO诱导的旋转圈数的比较  2组治疗前比较差异无统计学意义(P0.05)；治疗组治疗结束后第1天旋转圈数有

11、所下降，但与治疗前比较，差异无统计学意义(P>0.05)；治疗结束后第14天、28天旋转圈数减少，与治疗前、对照组同一时间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。表1  2组同一时间点旋转圈数的比较 注：与治疗前比较，P<0.05;与对照组比较，P<0.05    2.2  启动潜伏期  治疗前2组比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗组rTMS治疗结束后第1天、第14天、第28天启动潜伏期明显缩短(P0.05)，与对照组同一时间点比较

12、差异有统计学意义(P<0.05)。对照组各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。表2  2组不同时间点启动潜伏期的比较注：与治疗前比较，P<0.05;与对照组比较，P<0.05    3  讨  论    与单次、成对磁刺激比较,rTMS可以对皮质兴奋性产生较为持久的影响,并随频率和强度的改变而起不同的作用。高频率rTMS(>5 Hz,有文献报道为>1 Hz)可以提高皮质的兴奋性,而低频rTMS则抑制皮质的兴奋性。    经颅

13、磁刺激技术尽管已应用到PD患者的诊断和治疗，但研究结果并不一致。多数研究认为有不同程度的效果4，5，但Okabo等6用0.2 Hz,1.1皮质活动阈值，每次100个刺激，每周1次，共8周，与假刺激组相比，没有发现rTMS的优势。这可能因为临床PD患者混杂因素多，且受药物情绪的影响较大，故很难达到条件一致性。而本研究采用PD大鼠模型，通过运动诱发电位(TMSMEP)检测运动皮质静息阈值，并给予rTMS治疗，弥补了以上不足。6OHDA PD模型是国际公认的PD动物模型，其行为检测明显,神经化学改变更接近人类PD。APO诱导的PD大鼠的旋转圈数与黑质DA能神经元受损的程度呈正相关，旋转圈数可以作为反

14、映PD大鼠黑质DA能神经元受损程度的指标。运动迟缓、起步困难是PD的一个典型症状，僵住实验为一种可行的检查手段。因此，我们利用这2个指标来判断rTMS对PD模型大鼠行为的影响。    多数研究认为PD患者的皮质阈值降低，兴奋性较正常人高，而低频rTMS可以抑制皮质的兴奋性。故本试验选用频率0.5Hz、阈上30%强度，每天一个序列，连续刺激2周的方法。结果显示APO诱导的旋转圈数治疗组随时间延长逐渐下降，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；大鼠患肢的启动潜伏期治疗组较对照组明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。说明低频rTMS可以改善PD

15、的行为学，并延缓病情进展。Mally等7也有同样的报道，他比较了单纯药物组与药物加磁刺激治疗组在药量、症状的恶化等方面的差异。接受磁刺激(频率1 Hz)治疗者每年至少2次，每次7 d，连续3年，结果发现磁刺激治疗组尽管治疗之初病情重、左旋多巴用量大，但3年之后无病情恶化，且未发现不良作用；而单纯药物组不但左旋多巴的用量明显增加，且病情明显恶化。    rTMS作用机制：(1)可能通过调节儿茶酚胺的代谢而发挥作用。Ohnishi等8研究发现rTMS可影响脑内儿茶酚胺的代谢，促进同侧内源性多巴胺释放，使同侧尾状核周围多巴胺增多，并可以抑制大脑内神经系统多巴胺的分解，进

16、而调节患侧纹状体苍白球直接环路和间接环路的兴奋性，改善运动障碍等临床症状。(2)可能与神经营养因子的分泌有关。经过长时间rTMS刺激后，脑源性生长因子mRNA的表达在海马、顶叶和梨状区皮质明显增高。在低频rTMS刺激后，在海马可以见到苔状纤维芽生9。林宏等10等观察到rTMS 14 d后SD大鼠苍白球外侧部和腹侧苍白球HMW MAP2染色明显增强，纤维明显增粗，推测rTMS可能通过树突重塑导致突触传递的变化而发挥其临床作用。(3)可能与调节皮质的兴奋性有关。【参考文献】1 Thomas J,Wang J,Takuba H,et al.A 6OHDA induced selective Park

17、insonian rat model:further biochemical and behavioural characterizationJ.Exp Neurol,1994,126(2):159161.2 包新民,舒斯云.大鼠脑立体定向图谱M.北京：人民卫生出版社,1991:4854.3 严莉,丰宏林,崔丽英.经颅重频磁刺激对大鼠脑缺血再灌注损伤后运动皮质兴奋性和神经功能的影响J.中国临床康复,2006,10(18):7981.4 Siebner HR,Rossmeier C,Mentschel C,et al.Shortterm motor improvement after subth

18、reshold 5Hz repetitive transcranial magnetic stimulation of the primary motor hand area in Parkinson's diseaseJ.J Neurol Sci,2000,178(2):9194.5 Fregni F,Sontos CM,Myczkowski ML,et al.Repititive transcranial magnetic stimulation in Parkinson's diseaseJ.Neurol Neurosueg Psychiatry,2004,75(8):1

19、 1711 174.6 Okabo S,Ugawa Y,Kanazawa I.0.2Hz repetitive transcranial magnetic stimulation has no addon effects as compared to a realistic sham stimulation in Parkinson's diseaseJ.Mov Disord,2003,18(4):382388.7 Mally J,Farkas R,Tothfalusi L,et al.Longterm followup study with repetitive transcranial