反向聚合酶链式反应测定Ewing肉瘤患者骨髓微小残留病变

1、    反向聚合酶链式反应测定Ewing肉瘤患者 骨髓微小残留病变        【摘要】目的建立以EWS-FLI-1融合基因为标志，用反向聚合酶链式反应(PCR)测定骨髓Ewing肉瘤细胞的体系。方法用RPMI 1640培养液培养Ewing肉瘤T1细胞系，将其与正常人骨髓单个核细胞按比例混合，使T1细胞浓度依次为100%，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，0，提取总RNA，合成cDNA，PCR扩增EWS-FLI-1；同时选择5例骨髓转移的Ewing

2、肉瘤患者，测定诊断时及缓解后骨髓EWS-FLI-1融合基因。结果T1细胞浓度为100%，10-310-6时，EWS-FLI-1均阳性；10-7及0时阴性。5例患者诊断时骨髓EWS-FLI-1均阳性，完全缓解后2例转阴。结论以EWS-FLI-1融合基因为标志的反向PCR测定骨髓Ewing肉瘤细胞的灵敏度为10-6，它是测定骨髓Ewing肉瘤细胞高度敏感的方法；Ewing肉瘤患者完全缓解时，部分患者骨髓仍存在肿瘤细胞。【主题词】Ewing 氏肉瘤；骨髓；聚合酶链反应Minimal residual disease in bone marrow in patients with Ewings sar

3、coma detected by RT-PCR amplification of EWS-FLI-1 fusion gene transcriptTANG Suoqin, HUANG Dongsheng, ZHANG Xiaofei.（ Department of Pediatrics, PLA General Hospital, Beijing 100853, China）【Abstract】ObjectiveTo set up a system for sensitively detecting minimal Ewings sarcoma cells in bone marrow. Me

4、thodsEwings sarcoma cell line T1 cells were serially diluted with normal bone marrow cells so that the concentration of tumor cells was 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, and 0, respectively. Total RNA was isolated from these samples and cDNA was synthesized. EWS-FLI-1, a fusion gene formed due to chromo

5、some translocation, was amplified with PCR. Bone marrow samples from five patients with Ewings sarcoma patients with tumor metastasis were examined for EWS-FLI-1 transcript.ResultsT1 cells could be detected when one was present in 106 normal bone marrow cells. Thus the sensitivity of detection was 1

6、0-6. A 434 bp EWS-FLI-1 transcript was detected in five Ewings sarcoma patients examined at the time of diagnosis. After complete remission, EWS-FLI-1 was still positive on RT-PCR in 3 patients, although BM pathological examination was negative in all cases. ConclusionRT-PCR for EWS-FLI-1 is sensiti

7、ve enough to detect minimal residual Ewings sarcoma cells in the bone marrow. It can identify residual tumor cells in pathologically negative bone marrow specimens. 【Subject words】Ewings sarcoma; Bone marrow; Polymerase chain reactionEwing肉瘤为儿童常见的骨骼组织恶性肿瘤，它可转移至骨髓，检测骨髓微量Ewing肉瘤细胞（称微小残留病变，MRD）对判断病情及对治

8、疗的反应具有重要意义。我们建立反向聚合酶链式反应(PCR)测定骨髓微量Ewing肉瘤细胞的体系，并测定Ewing肉瘤患者骨髓MRD。材料与方法1.Ewing肉瘤细胞系T1细胞：细胞由美国洛杉矶儿童医院Siegel教授惠赠，此细胞含t（11，22）（q24，q12）。T1细胞用RPMI 1640培养液培养，5% CO2，3 d换液1次。2.灵敏度试验：取正常人骨髓5 ml，淋巴细胞分层液分离单个核细胞，与T1细胞按比例混合，使T1细胞浓度依次为10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，100% T1细胞及100%正常人骨髓分别做阳性及阴性对照，反向PCR检测上述7个标本中EWS-FLI-

9、1融合基因。3.临床资料：患者5例，年龄11.2±1.3岁。男4例，女1例。原发部位髂骨2例，股骨1例，肱骨1例，腓骨1例。诊断时组织学检查骨髓均受累，肿瘤细胞比例1.5%5%。确诊后取骨髓1 ml，分离单个核细胞，PCR检测MRD。患者采用手术、放疗、化疗（长春新碱1.5 mg/m2+环磷酰胺500 mg/m2，每周1次）进行治疗，缓解后复查骨髓涂片及骨髓MRD，骨髓穿刺部位均为髂后上棘，两次穿刺为同侧。4.MRD检测：采用反向PCR，总RNA提取采用氰化物-酚-氯仿法1，cDNA采用药盒合成(BRL产品)，简述如下：Oligo（dt）12-18 1 l，总RNA 1 l，5倍首链

10、缓冲液4 l，0.1 mol/L DTT 2 l，DNTP(每种10 mmol/L) 1 l，逆转录酶（PE产品）1 l及DEPC处理水，总容积20 l，42 1 h，然后95 5 min终止反应。根据文献报道的序列合成PCR引物2，11.3 5ACT CCC CGT TGG TCC CCT CC-3；22.3 5- TCC TAC AGC CAA GCT CCA AGT TC-3。PCR体系50 l，组成为：10倍缓冲液5 l，cDNA 8 l，引物各1 l（20 pmole/l），Taq DNA聚合酶0.25 l(PE产品)，DEPC处理水34.75 l。PCR条件：94，30 s，65，

11、1 min，72，2 min，30次循环。取PCR产物15 l，在1.5%琼脂糖胶上电泳，EB染色，观察结果，照相。结果1.灵敏度实验：EWS-FLI-1融合基因为434 bp的片段；电泳结果显示当T1细胞浓度为100%，10-3，10-4，10-5，10-6时，均可看到434 bp的片段；而T1细胞浓度为10-7时，无任何条带，正常骨髓亦未见到阳性条带。表明RT-PCR检测骨髓Ewing肉瘤细胞的灵敏度为10-6，即100万个骨髓细胞中有一个Ewing肉瘤细胞时即可检测出。2.PCR电泳结果：5例Ewing肉瘤患者确诊时，骨髓均可见到大小为434 bp的片段，未见其他片段，表明EWS-FLI

12、-1均阳性。患者治疗后13个月完全缓解，缓解后组织学检测骨髓均未发现肿瘤细胞，反向PCR检测3例仍可见434 bp的条带，但另外2例未见任何条带。讨论Ewing肉瘤起源于骨组织，分化差，常见部位是四肢，可发生于盆腔、胸壁、脊柱、头颈部，常转移至肺、骨及骨髓3。近年来自体骨髓移植已越来越多的用于Ewing肉瘤的治疗。骨髓微小残留病变的测定对自体骨髓移植具有重要意义，因为自体移植有将肿瘤细胞重新植入导致肿瘤复发的可能，如果选择治疗至骨髓微小残留病变阴性时，再行移植有可能减少移植后复发率。传统上骨髓组织学检查Ewing肉瘤细胞的灵敏度较低，约为1%，需探索新的方法。近年来PCR由于灵敏度高，在白血病

13、患者骨髓MRD测定中得到了应用。PCR测定MRD时所测定的肿瘤细胞需有较特异的肿瘤标志。在Ewing肉瘤，用传统的细胞遗传学方法检测时，85%患者存在t（11，22）（q24；q12）4，这种移位，使22号染色体上的EWS基因和11号染色体上的FLI-1基因连接在一起，形成融合基因，此融合基因有很高水平的表达。t（11，22）（q24；q12）对Ewing肉瘤和原发性神经外胚层肿瘤（PNET）是特异性的，其他肿瘤很少出现5。PNET在起源上与Ewing肉瘤相似，其生物学特性、治疗非常相近，故EWS-FLI-1可作为理想的肿瘤分子标志，用来测定微量Ewing肉瘤细胞6。随着EWS和FLI-1基因

14、各自切点的不同，形成PCR产物，除434 bp外，还可能形成介于300700 bp间其他的PCR产物。本组患者均为434 bp，反映了大部分患者EWS和FLI-1酶切位点相似的规律。PCR敏感性较高，本组测定以EWS-FLI-1为指标的反向PCR的灵敏度为10-6。每次实验时设阴性对照及阳性对照可较好地避免假阳性及假阴性。5例Ewing肉瘤患者确诊时骨髓均有侵犯，结果EWS-FLI-1均阳性，说明RT-PCR的敏感性为100%。本研究在预实验时同时测定了5例特发性血小板减少性紫癜患者骨髓EWS-FLI-1，结果均阴性，说明其特异性为100%。5例Ewing肉瘤确诊时用PCR测定骨髓MRD均阳性

15、，与组织学检测结果一致。完全缓解后组织学检测肿瘤细胞阴性，而反向PCR测定3例仍阳性，提示放疗、化疗未能彻底清除骨髓转移，需进一步治疗。对PCR测定Ewing肉瘤骨髓MRD的临床意义需进一步观察、评估。本研究结果提示，以EWS-FLI-1为标志的反向PCR对诊断Ewing肉瘤患者骨髓微量转移有意义，EWS-FLI-1也可作为判断疗效的重要依据之一。作者单位：唐锁勤（北京解放军总医院小儿内科，100853）黄东生（北京解放军总医院小儿内科，100853）张晓飞（北京解放军总医院小儿内科，100853）参考文献：1Chomczynski P, Sacchi N. Single step metho

16、d of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162:156-159.2Delattre O, Zucman J, Plougastel B, et al. Gene fusion with an ETSDNA-binding domain caused by chromosome translocation in human tumors. Nature, 1992,359:162-165. 3Cangir A,Vietti TJ,Gehan

17、 EA, et al. Ewings sarcoma metastatic at diagnosis, results and comparisons of two intergroup Ewings sarcoma studies. Cancer, 1990,66:887-891.4Stephenson CF, Bridge JA,Sandberg AA. Cytogenetic and pathologic aspects of Ewings sarcoma and neuroectodermal tumors. Human Pathol, 1992,23:1270-1276. 5Dehner LP. Neuroepithelioma (primitive neuroectodermal tumor), and Ewings sarcom