大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺

1、1. 提取目的基因 :既从人的 DNA中提取胰岛素基因 , 可使用限制性内切酶将目的基因 从原 DNA中分离 .2. 提取质粒 :使用细胞工程 , 培养大肠杆菌 , 从大肠杆菌的细胞质中提取质粒, 质粒为环状DNA.3. 基因重组 :取出目的基因 与质粒 , 先利用同种限制性内切酶将质粒切开 , 再使用 DNA连接酶将目的基因与质粒 " 缝合 ", 形成一个能表达出胰岛素的 DNA质粒 .4. 将质粒送回大肠杆菌 :再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质 , 如 CaCl2, 这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中, 大肠杆菌便会将 重组质粒 吸收 .5.

2、 胰岛素的产生 :再大肠杆菌内 , 质粒通过表达转录与翻译后 , 便产生出胰岛素蛋白质 . 通过大肠杆菌的大量繁衍 , 便可大量生产出胰岛素 !学习要求知道 DNA的粗提取与鉴定的原理； 掌握并能分析 DNA粗提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。一、基础知识【活动 1】阅读教材 P54“基础知识”，讨论并回答下列问题：1（记忆） 提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。2（记忆） DNA的溶解性特点：DNA在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度不同； DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。【思考

3、 1】据图 51 分析：DNA在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度有何特点在L 时溶解度最小；要使 DNA溶解，需要使用什么浓度较高浓度，可使DNA溶解；要使 DNA析出，又需要使用什么浓度L 可使 DNA析出。【思考 2】利用 DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。3（记忆） DNA的耐受性特点：蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；在 6080时蛋白质变性沉淀而DNA分子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。4（记忆） DNA的鉴定原理当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定。在沸水浴条件下，该试剂与DNA反应，呈现（浅）

4、蓝色。二、实验设计【活动 2】阅读教材 P55“实验设计”，讨论并回答下列问题：1（记忆） 实验材料的选取：选取材料时应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。【思考 3】你认为教材提供的材料中哺乳动物的血液不适合提取DNA。2（记忆） 破碎细胞，获取含DNA的滤液：鸡血：向鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并玻棒搅拌，用纱布过滤后，收集滤液。洋葱：向研钵中加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，用纱布过滤后，收集滤液。【思考 4】在以上实验中，蒸馏水的作用是使血细胞大量吸水而胀裂，洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，食盐的作用是溶解DNA物质。3（学会） 去除滤液中的杂质：方案一： 30mL滤液加 NaCl

5、使 DNA溶解过滤得滤液加蒸馏水使DNA析出过滤得过滤物放到2mol/LNaCl 溶液中溶解 DNANaCl 溶解液方案二： 30mL滤液加嫩肉粉（木瓜蛋白酶）静置10 分钟得 DNA滤液方案三： 30mL滤液 60 67处理过滤得DNA滤液【思考 5】以上三个方案的原理分别是什么方案一原理： DNA在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度不同；方案二原理：蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三原理： DNA耐高温而蛋白质不耐高温。【思考 6】方案一中：“加NaCl 使 DNA溶解过滤得滤液”的目的是除去不溶（可溶、不溶）于NaCl 溶液中的细胞杂质；“加蒸馏水使DNA析出过滤得过滤物”的目的是除去

6、可溶（可溶、不溶）于NaCl 溶液中的细胞杂质。4（记忆） DNA的析出：DNA滤液与等体积冷却酒精混合， 静置一段时间后析出的白色丝状物就是DNA。5（记忆） DNA的鉴定：取 2 支洁净的试管，编号甲、乙，各加入等量的2mol/L NaCl 溶液。甲中放入少量白色丝状物，使之溶解。在甲、乙试管中各加4mL二苯胺，混合均匀。沸水浴 5min，观察颜色变化，甲试管呈现蓝色。三、操作提示【活动 3】（记忆）阅读教材P56“操作提示”和P57“课题延伸”，关注下列注意事项：1在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心后除去血浆，以提高细胞悬液浓度。2实验中使用塑料烧杯和尼龙布，以免DNA被吸附。

7、3玻棒沿同一方向缓慢搅拌（细胞破裂时快速搅拌），玻棒不要碰到烧杯壁。4二苯胺试剂要现用现配。5为提高 DNA纯度，实验中通常使用的洗涤剂有CTAB、 SDS等。【活动 4】观看视频： 观看“ DNA的粗提取与鉴定”视频，体会并学会相关技术方法。课后学习1尝试从植物组织中提取DNA分子。2基础训练册：将基础知识整理到作业本上；完成该节训练题。学习要求尝试 PCR技术的基本操作， 体验 PCR技术的分子生物学实验方法； 理解 PCR技术的原理；讨论 PCR技术的应用【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。一、基础知识【活动 1】阅读教材 P58“PCR原理”，

8、讨论并回答下列问题：1（记忆） PCR技术扩增 DNA的过程与细胞内的DNA复制过程类似。【思考 1】填写下表： （记忆） 细胞内 DNA复制条件分析条件参与的组分在 DNA分子复制中的作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成 DNA子链的原料解旋酶打开 DNA双螺旋RNA聚合酶合成 RNA引物酶DNA聚合酶催化合成 DNA子链；切除引物DNA连接酶将不连续的 DNA子链连接起来能量ATP为解螺旋和合成子链提供能量引物RNA为 DNA聚合酶提供合成的 3端起点2（理解） 细胞内 DNA的复制（ 1） DNA的结构：脱氧核苷酸分子通过 3,5 磷酸二酯键连接形成核苷酸长链，两

9、条脱氧核苷酸长链反向平行排列并螺旋化，形成 DNA双螺旋结构。（ 2）DNA的复制：首先，在解旋酶的作用下，由 ATP供能， DNA发生解旋形成两条 DNA单链。其次，在 DNA单链的 3端，在 RNA聚合酶在作用下， 合成 RNA引物。再次，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3端开始合成 DNA子链。最后， DNA聚合酶将引物切去，并合成空缺处DNA单链，再由 DNA连接酶将不连续的 DNA子链连接起来。3（记忆） DNA分子复制的人工控制解开螺旋：在 80100时， DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。恢复螺旋：在5060左右时，两条 DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。复制

10、条件：缓冲液， DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。控制仪器： PCR仪（温度周期性自动调节仪）。【思考 2】缓冲液相当细胞内的什么成分核液。【活动 2】阅读教材 P59“PCR的反应过程”，讨论并回答下列问题：1（记忆） 填写 PCR反应流程：2（理解） PCR反应过程是：在升温至90以上时 DNA解旋；在降温至50左右时引物与 DNA单链结合；在升温至72左右时合成 DNA子链。二、实验操作【活动 3】阅读教材 P62“实验操作”，讨论并回答下列问题：1（记忆） 在 PCR反应体系的配方中，含有的成分有缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种RNA

11、引物、水。2（了解） 实验操作步骤：按照PCR反应体系配方配制反应液；将PCR反应体系 50L 用微量移液器转移到微量离心管（）中；将微量离心管放到PCR仪中；设置 PCR仪的工作参数； DNA在 PCR仪中大量扩增。3（了解） 水浴法：将微型离心管依次在95、 55、 72恒温水浴锅中循环处理。三、操作提示【活动 4】阅读教材 P62“操作提示”，讨论并回答下列问题：1（记忆） 避免外源 DNA污染，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。2（记忆） 将缓冲液和酶分装成小份，20低温保存。3（记忆） 每添加一种反应成分，更换一个移液器枪头。4（记忆） 混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。四、结果分析与评价【活动 4】阅读教材 P63“结果分析与评价”，讨论并回答下列问题：1（记忆） 反应液稀释：取 2LPCR反应液，添加 98L 蒸馏水。2（记忆） 分光光度计调零：将100L 蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计读数调节为