基因表达应用示例通过实时荧光定量PCR技术实现对miRNA靶向物

1、基因表达应用示例通过实时荧光定量PCR 技术1 导言实现对 miRNA 靶向物小 RNA （miRNAs ）是一种内源性非编码蛋白的小分子RNA ，它们是许多基础的mRNAs 的相对定量分析细胞过程中基因表达的主要调节因子，这些过程包括细胞增殖、 细胞分化以及细胞凋亡等。 miRNA在肿瘤生长过程中也发挥着重要作用。一般来说，miRNA 通过控制翻译过程来实现对目标蛋白表达的调控。然而，在靶向 mRNA降解水平上的基因表达的调控已有报道。因此，有证据显示miRNA 能够通过 RNA 降解来实现对细胞内mRNA 浓度的直接调控， 而且也会通过靶向作用于蛋白质级联来调控mRNA 水平，这些蛋白质级

2、联能够调控下游转录或在转录后对mRNA 水平进行调控。在当前的研究中， 我们重点关注 miRNA hsa（人） miR-21 ，研究发现在乳腺癌和其他肿瘤中 miR-21水平上调。更进一步的研究发现， miR-21在细胞凋亡和细胞生长过程中也发挥着功能性作用。 为了进一步对 miR-21进行研究，我们研究了miR-21的水平对三个假定的 miR-21 靶向基因 （PDCD4 ，PTEN和 TLR2 ） mRNA 表达的影响（见图1）。2 材料和方法细胞培养qRT-PCRDMEM 培养基中补充1%的 L- 谷氨酰基因表达分析胺， 1%的盘尼西林 /链霉素， 10%的 FBS，在在 384 孔板上

3、 11ul/孔的总反应体积中，+37 5%CO 2 条件下培养HeLa 细胞。用使用荧光 Universal ProbeLibrary （ UPL ）探针miRNA 21 miRIDIAN类似物， miRNA类似（罗氏公司）和 ABI7900HT实时仪器（美物 miRIDIAN 对照，miRNA 21 mi RIDIAN抑国应用生物系统公司）以及2X FastStart制剂和 miRNA miRIDIAN抑制剂对照 siRNAUniversal Probe Master （ Rox）PCR 试剂（罗（ dhar-macon 都 为50nM ）， 以 及氏公司）进行定量RT-PCR。每次反应的X

4、-tremeGENE siRNA转染试剂（罗氏公司） ， cDNA/RNA 浓度为 10ng 。ABI7900HT 实时按照生产商的方案进行转染。RNA 提取与逆转录在 转 染 之 后 两 天 ， 使 用HighPure RNAIsolation Kit （罗氏公司），按照生产商的建议从 HeLa 细胞中提取总 RNA （每个类似物miRNA 三个生物学复制） 。同时，使用 High Pure miRNA Isolation Kit （罗氏公司），按照使用说明书上的指导，提取包含小分子量RNA 在内的总RNA （两个生物学重复） （见图 2）。按照生产商的指导，使用 Transcriptor

5、First Strand cDNA Synthesis Kit （罗氏公司）和 oligo（ dT）18 与随机六聚体引物的混合物，按照每次反应 500 到 1000ng 总 RNA 的量进行第一链 cDNA 的合成。用 miRCURY LNA First-strand cDNA Kit （ Exiqon ）进行 miRNA第一链 cDNA 的合成，每次反应使用 4ng 含有小 RNA 在内的总 RNA 。仪器（美国应用生物系统公司）的PCR 条件如下： +95下变性15 分钟， +95 下扩增15 秒，最后在 +60下延伸 60 秒。miRNA 定量使用 LightCycler? 480 实

6、时荧光 PCR 仪（罗氏公司）， 在 384 孔板的模式下，设定反应体积为 20ul ，以 1:10 梯度稀释 cDNA ，在 miRCURY LNA SYBR Green master mix ， miRCURY LNA 内源性对照 SNORD44 和 miR-21 的 LNA PCR 引物（ Exiqon ）的共同作用下进行 miRNA qRT-PCR. LightCycler? 480 仪的 PCR 条件如下： 95变性 10 分钟，95变性 10 秒， 60延伸 20 秒，反应设 40个 循 环 。 使 用 Ct方 法 （ Livak和Schmittgen ，2001 年），用 HPR

7、T1 和 GAPDH作为参考（管家基因）基因，来反映假定的靶向基因表达水平上的成倍变化。对于hasmiR-21 ，则用非靶向合成类似物- 和抑制剂-miRIDIAN 作为 miRNA 转染 HeLa 细胞的实验对照。培养 HeLa 细胞用 miRNA miRIDIAN 类似物和 miRNA 类似物 miRIDIAN对 照 ， 以 及 miRNA 21miRIDIAN 抑 制 剂 和 miRNA miRIDIAN 抑制剂对照 siRNA 转染 HeLa 细胞。图 1： 利用假定的 miR-21靶向基因 （ PDCD4 ，PTEN和 TLR2 ）的表达水平分析从而对 has miR21 进行分析的

8、工作流程。提取 miRNA提取总 RNAqRT-PCR-miRNA定量qRT-PCR- 基因表达分析图 2：用指定试剂 （miRIDIAN miRNA类似物或 miRIDIAN miRNA抑制剂） 转染 HeLa 细胞后，用 Agilent 生物分析仪对来自不同细胞集群的小分子量 RNA 进行凝胶电泳。3 结果和讨论为了分析 miR-21 水平升高对靶向基因（PDCE4 ， PTEN 和 TLR2 ）的 mRNA 水平的影响，我们使用 UPL 通用探针库探针（罗氏公司）和 ABI 7900HT 实时 PCR 仪（美国应用生物系统公司）对已经报道的能够被 miR-21 调控的一些 mRNA 的丰

9、度进行了定量测定。使用 X-tremeGENE siRNA 转染试剂（罗氏公司），用 miR-21 的类似物和抑制剂对 HeLa 细胞进行转染， 并分别设置 （ miRNA21 miRIDIAN 类 似 物 对 照 ， miRNA miRIDIAN 类似物对照， miRNA 21 抑制剂和miRNA抑制剂对照siRNAs ）。 miRIDIANmiRNA 类似物是一种合成的双链结构， 能够代 表 对 靶 向 mRNAs 进 行 调 控 的 成 熟 miRNAs ，与内源性 miRNAs 类似。与之相反，miRIDIAN miRNA 抑制剂是一种不可水解的成熟 miRNA 的反向互补单链， 在转

10、染细胞之后能够降低内源性 miRNAs 的活性。这极有可能是由于抑制剂与成熟 miRNA 之间进行不可逆结合造成的（ Meister, Landthaler 等，2004）。我们在 LightCycler? 480 （罗氏公司） 上进行qRT-PCR，对 miR-21 的 miRIDIAN 类似物和抑制剂对成熟 miR-21 水平的影响进行了定量测定。使用 High Pure miRNA Isolation Kit （罗氏公司）提取 miRNA ，用 qRT-PCR 与 miRCURY LNA 进行定量检测，并用小分子量非编码核仁 RNA SNORD44 进行校准。与用 miRIDIAN 类似

11、物处理的对照细胞相比较，用 50nM miR-21 的 miRIDIAN 类似物转染细胞后， HeLa 细胞中 miR-21 的浓度上升了 7.3 倍（见图 3）。与之相反，用 50nM miR-21 的 miRIDIAN 抑制剂转染 HeLa 细胞后，miR-21 水平下降了77%（见图 3）。这表明，X-tremeGENE siRNA转染试剂（罗氏公司）是一种非常好的转染工具，能够有效地将miRIDIAN 类似物和 miRIDIAN 抑制剂转染到目标细胞中。而且我们还发现， High PuremiRNA Isolation Kit （罗氏公司）能够有效地提取 miRNA ，并用于之后 mi

12、RNA 浓度的分析。在使用 miRIDIAN 类似物和抑制剂上调和下调细胞内 miR-21 浓度之后，我们对 miR-21 公认的靶向 mRNAs（PDCD4 ， PTEN 和 TLR2 ）的表达水平进行了研究。在用miR-21 的类似物和抑制剂以及各自的对照物感染 HeLa 细胞两天之后，用High Pure RNAIsolationKit （罗氏公司）提取总RNA 。在ABI 7900HT （美国应用生物系统公司）上使用 qRT-PCR 和 UPL 通用探针库探针对 mRNA水平进行定量测定，并与对照基因（管家基因） HPRT1 和 GAPDH 正常的基因表达水平进行比较。 我们发现， 与

13、对照组相比， miR-21 的过度表达导致 PDCD4（编码人致瘤性转化抑制物）的 mRNA 水平显著下降了 29%（见图 4）。最近的研究发现， mi-R-21 过度表达能 够 在 蛋 白 质 水 平 和 mRNA 水 平 上 对PDCD4 基因造成影响 （ Frankel，Christoffersen等人， JBC ，2008，283），该实验的结果进一步证实了这一发现。与之相反，在PTEN 的 mRNA （编码人同源性磷酸酶 -张力蛋白）水平上没有观察到miR-21 的影响。在上调或下调miR-21 水平之后都是这种情况（见图5）。最近的研究发现 miR-21能够通过影响翻译过程而在蛋白

14、质水平上对PTEN 产生影响，而 PTEN mRNA水平则不发生变化（Wickramasinghe 等人，2009，NAR ）。我们的研究与这一发现相符。有意思的是，与抑制剂转染对照细胞相比，在用 miR-21 抑制剂转染细胞之后，TLR2（编码 toll 样受体 2）mRNA 水平显著下降了 57%（见图 6）。miR-21 和 TLR2 都在细胞凋亡调控过程中发挥作用， TLR2 可能是 miR-21 抗细胞凋亡活动的重要介质。 TLR2 是 miR-21 活性的直接还是间接靶向基因尚不清楚，仍有待研究。=1.0 ）表达倍数变化miR21 抑制剂miR21 类似物图 3：miR-21 表达

15、的高水平变化。 图中显示的是在 miR-21 抑制（黄色条）或过表达（蓝色条）之后的 miR-21 水平，分别与各自的抑制剂和类似物对照转染细胞（红色虚线 =1.0 ）进行比较。表达倍数变化miR21 抑制剂miR21 类似物图 5：miR21 水平调节对 PTEN 基因表达的影响。当细胞内 miRNA-21 浓度发生变化时， PTENRNA 的 mRNA 水平并不发生变化。图中显示的是 分 别 在 miRNA-21 过 表 达 （ 黄 色 条 ） 和miRNA-21 抑制（蓝色条）之后 PTEN 基因 mRNA 的表达水平，分别与各自对照的抑制剂和类似物转染细胞（红色虚线=1.0 ）进行比较

16、。表达倍数变化miR21 抑制剂miR21 类似物图 4 ： miR21 对 PDCD4 基因表达的调控。mRNA-21 过表达（蓝色条）导致 PDCD4 mRNA 水平下降，而 miRNA-21 下调（黄色条）并不影响 PDCD4 的 mRNA 水平，分别与各自的抑制剂和类似物对照转染细胞（红色虚线=1.0 ）进行比较。表达倍数变化miR21 抑制剂miR21 类似物图 6：miR-21 水平调节对 TLR2 基因表达的影响。miRNA-21 抑制（黄色条）并不会影响 TLR2mRNA 水平，而 miR-21 过表达（蓝色条）会导致 TLR2 mRNA 水平下降，分别与各自对照的抑制剂和类似

17、物转染细胞（红色虚线进行比较。4 结论在该研究中，我们分析了hsa miR-21 对三个公认的靶向基因（PDCD4 ， PTEN 和TLR2 ）在mRNA表达水平上的影响。人miR-21应答通过外源性miRNAmiRIDIAN类似物和抑制剂 （ Dharmacon）进行调控， 使用 X-tremeGENE siRNA 转染试剂（罗氏公司）能够轻松实现类似物与抑制剂向HeLa细胞的转染过程。为了分析 miR21 水平，罗氏公司的HighPure miRNA Isolation Kit为之后进行qRT-PCR 扩增提供了高质量的模板。该扩增过程用 miRCURY LNA First-strand

18、cDNA 试剂盒， miRCURY LNA SYBR Green MasterMix ，miRCURY LNA内源性对照SNORD44和 LNA miR-21 PCR 引物（ Exiqon ），在LightCycler? 480 实时荧光 PCR 仪（罗氏公司）上进行。参考文献1. Livak, K.J. and Schmittgen, T.D. (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T) Method. Methods

19、, 25, 402-408.2. Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y. and Tuschl, T. (2004) Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing. RNA, 10, 544-550.3. Frankel, L.B., Christoffersen, N.R.,Jacobsen, A., Lindow, M., Krogh, A. and Lund, A.H. (2008) Programmed cell death 4 (PDCD4) is an important functional target of the microRNA miR-21 in breast cancer cells. J Biol Chem, 283, 1026-1033.为了对假定目标基因进行基因表达分析，我们在工作流程中使用 High Pure RNA Isolation Kit （罗氏公司） 进行 RNA 提取， 使用 Transcriptor