厨余垃圾高温堆肥中嗜热细菌种群结构分析

1、厨余垃圾高温堆肥中嗜热细菌种群结构分析厨余垃圾高温堆肥中嗜热细菌种群结构分析中国环境科学 2007,27(6):733,737ChinaEnvironmentalScience厨余垃圾堆肥中嗜热细菌种群结构分析杨朝晖 ', 刘有胜 , 曾光明 , 肖勇 , 杨恋 ( 湖南大学环境科学与工程学院, 湖南长沙410082)摘要 : 基于 16SrDNA的 PCR-变性梯度凝胶电泳 (DGGE)技术和系统发育分析 , 对厨余垃圾高温堆肥中嗜热细菌种群结构进行研究雌肥高温阶段 (>5O?) 持续 7d, 在此期间从堆体中采样并提取微生物总DNA,使用细菌通用引物 GC一 341F

2、/907R 从总 DNA中成功 PCR扩增出目标16SrDNA片段 , 对扩增 16SrDNA进行 ,-GE 分析 ,DGGE条带相似性 0 值分析和切胶测序 , 使用序列数据进行同源性分析并建立系统发育树 .DGGE和相似性 0 值分析结果表明 , 堆肥高温阶段有着比较丰富的细菌多样性 , 同时存在明显的优势种群结构变化; 切胶测序和系统发育分析结果表明 , 大部分高温阶段优势种群序列与芽孢杆菌属) 和梭菌属 (cf?触 "m)中的嗜热菌群具有较近的亲缘关系.关键词 : 厨余垃圾 : 高温堆肥 ; 变性梯度凝胶电泳 (DGGE);嗜热细菌 ; 系统发育分析 中图分类号 ;X172

3、文献标识码 ;A 文章编号 ;1000-6923(2o07)O6 0733-05Analysisofthermophilicbacterialcommunitiesstructureinhightemperaturecompostingofkitchenwaste.YANGZhaohui',LIUYou sheng,ZENGGuangming,XIAOY0n吕 YANGLian(CollegeofEnvironmentalScienceand Engineering,HunanUniversity,Changsha410082,China).ChinaEnvironmentalScie

4、 nce,2007,27(6):733,737Abstract:Usingbaseonthepolymerasechainreaction(PCR)of16SrDNAdenaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE)techniqueandphylogeneticanalysis,thethermophilicbacterialcommunitiesstructureinhightemperaturecompostingofkitchenwasteWasstudied.Thecompostinghigh-temperaturestage(>5O?

5、)continued7days,inthisperiod,samplingstackbodyandcollectingmicrobialtotalDNAoftheobject,16SrDNAfr agmentswereamplifiedusinguniversalbacteriaprimers(GC一341F/907R).TheDGGEanalysisWascaiedoutonamplificationof16SrDNA.The DGGEtwigbeltsimilarityCsvalueanalysisandcutgluesurveyorder,usingorderarr angedatato

6、carryoutsamesourcepropertyanalysis,andsystemphylogenetictreeWasestablished.Theanalysis resultsofDGGEandsimilarityCsvalueshowedthatthecompostinghightemperaturestagehadmorerichbacteriadivers ityandexistedobvioussuperiorcommunitystructurechange.Theanalysisresultsofcutsurveyorderandphylog eneticshowedth

7、atlargepartofhightemperaturestagesuperiorcommunityorderarrangepossessednearerbloodrelationwithBacillusandClostridium.Keywords:kitchenwaste;hightemperaturecomposting;denaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE);thermophilicbacteria;phylogeneticanalysis厨余垃圾属于易腐性有机垃圾, 有机物含量高 , 含水率高 , 热值低 . 高温堆肥化处理是一个重要途径

8、 . 堆肥高温阶段是木质素 , 纤维素和半纤维素等分子产生破坏 , 断裂和分解的主要阶段 ,也是有机质高效降解的主要阶段. 同时在堆肥高温阶段 , 堆肥中绝大部分的寄生虫, 虫卵 , 孢子和病原菌等被灭活 , 是保证堆肥无害化的重要阶段 . 因此 , 研究堆肥高温阶段嗜热细菌的种群结构及多样性 , 对于加快堆肥过程中有机质降解 , 缩短堆肥周期具有重要意义 . 研究表明 , 可培养微生 物仅占自然界微生物的0.1%,10%【lJ,因此传统纯培养方法无法全面反映微生物多样性的原始状态L2J.随着分子生物学和系统发育分析方法的发展, 基于16SrDNA基因的分子生物学方法逐 渐被用来分析复杂的生态

9、系统【3】 . 目前 , 聚合酶 链式反应一变性梯度凝胶电泳 (PCR-DGGE)技术 已逐渐运用于研究农田土壤【 61J, 活性污泥 J, 生物膜 J 中的微生物多样性 . 本试验运用 PCR-DGGE技术和系统发育分析研究厨余垃圾 堆肥高温阶段嗜热细菌种群结构和多样性动态变收稿 13 期:2007 0208基金项目 : 国家 "973" 项目 (2005CB724203);1家自然科学基金资助项 I(50478053); 湖南省自然科学基金资助项目 (04JJ3004,05JJ2004)责任作者 , 教授 ,yzh 日皿 ,一 : 高734 中国环境科学 27 卷化 ,

10、 为厨余垃圾堆肥过程中接种优势种群 , 加快堆 肥过程 , 缩短堆肥周期提供理论依据 .对测序结果进行同源性分析 , 根据同源性分析结 果使用 DNAStar5.0 分析软件建立系统发育树 . 1 材料与方法 2 结果与分析1.1 堆肥材料与处理从某大学食堂采集的厨余垃圾 16kg, 与 4kg 木屑 ,4kg 土壤混合于约 30L 的简易堆肥装置中 , 将堆肥装置移至恒温室 , 保持温度为 3O?.每 3d 进行 1 次翻堆 . 堆肥持续 18d, 每天取样 , 取样点分 布于堆体 4 个不同的位置 , 分别取样后混合 . 编号分别为 l,l8. 并实时测量温度 ,pH 值 , 含水率等 参

11、数 . 采集的样品于一 20C冰箱保存待分析 . 1.2 堆肥样品总 DNA的提取与 PCR扩增 称取 lg 堆肥样品 , 采用蛋白酶 K.CTAB法 IJUJ 进行总 DNA的提取 , 纯化采用异丙醇沉淀法 . 纯 化后的总 DNA 进行 PCR扩增 , 扩增引物采用细 菌通用引物 GC.341F3-5,11 和 907RI5】.1_3DGGE分析PCR扩增产物使用 1%琼脂糖进行凝胶电泳 ,目的条带用QIAquik.GelExtractionKit(Qiagen,Germany)回收 , 溶解于 6O无菌 Milli.Q 水中 . 取 3O纯化后的 PCR产物在进行电泳分离 , 电泳条 件

12、为凝胶变性梯度 35%-65%,电泳缓冲液为 lxTAE, 电压 140V,电泳温度 60"C, 电泳时间 16h. 经.EB 染色后用GelDoe2000凝胶成像系统 (Bio-Rad,USA) 观察结果并拍照 .1.4DGGE图谱相似性分析通过比较相似性系数 () 分析堆肥高温阶段指纹图谱的相似性 12-131,Cs 值变化范围为 !00.Cs:2j/(a+6,×100式中 :,b 分别代表堆肥不同天数较清晰的DGGE条带数目 ;, 指 a,b 中共有的条带数目 .1.5 切胶测序和系统发育分析在紫外灯下切下DGGE条带 , 洗净后于 6O 无菌 Milli-Q水中浸泡

13、 24h 以上 . 取2O进行 PCR扩增 , 扩增产物经 DGGE确认为单一条带后 .送交生物公司 ( 上海Sangon)lJ 序. 测序结果提交GenBank并获得接受号 . 使用 GenBank的 BLAST 2.1 厨余垃圾堆肥处理堆肥原料含水率为54.6%,pH 值为 6.7, 有机 质含量 ( 干重 ) 为 36.64%,C/N 为3O.Ol, 堆肥处理 18d 过程中高温阶段 (>5O?) 为 7d, 分别为第 7d(53?, 第8d(56C), 第 9d(58'C), 第 10d(64"C),第 lld(61?),第 12d(57"C)

14、, 第 13d(52C). 2.2高温阶段堆肥样品总DNA的提取与 PCR 扩增高温阶段堆肥样品中提取出基因组总DNA, 长度在 23kb 左右 .PCR扩增产物片段长度约为 630bp, 无明显非特异性扩增 , 各个样品的扩增产物均可作为变性梯度凝胶电泳 .2.3DGGE指纹图谱结果与值分析在 GelDoc2000 凝胶成像系统下 , 使用QuantityOneV4.52(Bio-Rad,USA) 软件对 DGGE凝胶进行成像 , 在 7 条泳道上共观察到 32 条不同的条带 ( 图 la). 图 lb 是凝胶成像系统 的成像照片经过软件分析和人工分析后绘制 的 DGGE图谱示意 , 简单描

15、述了各条带的相对 强度和分布 . 堆肥高温阶段 (7,l3d)Cs 值分析结 果见表 1.由 DGGE图谱 ( 图 la) 可见 , 堆肥高温阶段各时期细菌 16SrDNA序列使用PCR.DGGE分析得到了较好的分离 , 条带位置清晰 , 亮度明 显. 在高温阶段不同时期存在各自的优势条带 :第 7d 的条带 t, 第 8d 的条带 P,A, 第 9d 的条带 b,i,P,A, 第lOd 的条带 P,A, 第 1ld的条带 f,h,m,o,A,D,F'第 12d 的条带 W,A,D,F' 第 13d 的条带 P,A. 条带 P,A,D,F 几 乎存在于堆肥的整个高温阶段 , 基

16、本属于各时 期的优势条带 , 说明它们代表的嗜热细菌在52,64? 内均比较适宜生长 . 条带b,d,f,h, k,O,u,v,t只存在于某个单一的高温时期. 说明这些条带所代表的嗜热细菌只有相应的温度才适宜生长 . 由值 (7 一 l3d)分析结果 ( 表 1) 可见 , 高温阶段各时期之间的相似性值均6 期杨朝晖等 : 厨余垃圾高温堆肥中嗜热细菌种群结构分析735较低 , 值最高为 79( 泳道 10,12), 最低为 29( 泳 道 8,l1),其余值均在 30-77 之间 . 这说明高 温阶段温度变化过程中存在比较明显的嗜热细菌群落动态变化 . a.DGGE图谱789l0lll2l3a

17、b-. Cd-.e t一11 J-mp It-O nL一Sq一 t U ;,v.l_X 2A_一!CJ D , EF, b.DGGE条带强度图 1DGGE图谱和 DGGE条带强度示意Fig.1DGGEpatternsandDGGEbandintensity2.4 嗜热细菌系统发育分析DGGE图谱 ( 图 la)q15 条优势条带经切胶回收 ,PCR重扩增和 DGGE鉴定后 , 测序 , 共获得 l5 条不同的 16SrDNA序列 , 使用 GenBank的 Sequinwin32 将序列一次性提交给 GenBank,并 获得接受号 (EF396148,EF396162), 条带与接受 号之间的

18、对应关系见表2. 将15 条序列与GenBank 数据库中的序列进行比对, 获得同源性信息( 表2),并下载与其同源性最近的序列, 使用DNAStar5.0程序中的ClustalV方法建立系统发育树 ( 图 2).表 1DGGE图谱相似性值分析TablelThepairwisesimilaritycoefficientofDGGEprofile表 215 条序列的BLAST结果Table2Resultsof1sequencesusingBLAST中国环境科学 27 卷20151050棱蕾 t 警按卅 oo)图 2 嗜热细菌系统发育树Fig.2Phylogenetictreesofthermop

19、hilicbacterium由表 2 可见 . 切胶测序的 l5 条条带均可以在 GenBank 中找到与其序列同源性较高 (>9O%) 的 种群 . 根据同源性分析结果 ,15 条 DGGE优势条 带序列中有 l2 条属于芽孢杆菌属 (Bacillus) 的嗜 热细菌 ,2 条属于梭菌属 (Clostridium) 的嗜热细菌 , 另外 1 条条带 b 序列与菌种 Symbiobacterium thermophilum 同源性达到 96.7%. 由图 2 可见 , 测 序序列 A,f,F,D,h,t,P,i,i,S,Ill,0与数据库中 Bacillus 有很近的亲缘关系 ,

20、 其中测 序序列之间 S,m,o 亲缘关系最近 , 同属于芽孢 杆菌中比较类似的菌群 . 钡 4 序序列 Y,W与数据库 中 Clostridium 有很近的亲缘关系 , 测序序列 b 与 数据库中的Symbiobacteriumthermophilum菌种 有很近的亲缘关系 .3 讨论堆肥过程是微生物群落结构与堆肥温度相互制约的过程, 温度是堆体中微生物生命活动的重要标志 . 从 DGGE图谱 ( 图 1)和值分析结果(表 1) 可见 , 随着温度的变化, 各泳道之间DGGE条 带存在明显变化,各泳道之间值均较低, 不同的 温度适宜不同嗜热细菌的生长, 嗜热细菌在温度变化中存在更替过程. 在

21、DGGE图谱中ll泳道即第lld(61?)的条带亮度最明显, 泳道上的所有条带基本都属于优势条带( 包括条带 :f,h,j,m,o,A),结合系统发育分析对应的数据库中的种群为: Bacilluslicheniformis,B.circulans,最coagulans,B.kaustophilus,丑stearothermophilus,subtilis.说明堆肥第 1ld 的温度和堆肥基质适宜这些嗜热细菌的生长 , 从而使它们成为这一时期的优势种群 .Peter等【 1?5J 研究表明 , 优势芽胞杆菌适宜的生长温度为5o74?, 在堆肥高温阶段可以增强对难 降解有机物的分解和利用 , 提高

22、堆肥效率 . 泳道 l2 和泳道 l3 的 DGGE条带较多 , 但优势种群却不明 显 , 说明堆肥 l57"C)I13d(52"C) 的温度条件下 嗜热细菌都比较适宜生长没有绝对的优势种群 . DGGE条带切胶测序具体分析了厨余垃圾 堆肥高温阶段中嗜热细菌种群结构 , 结合DGGE图谱可以看出高温阶段嗜热细菌的群落变化 , 如 条带 b 仅存在于泳道 9, 说明条带 b 所代表的嗜热 细菌适宜的生长温度为 58?, 测序结果表明与种 群Symbiobacteriumthermophilum 具有很高的亲 缘关系 . 而条带 P 几乎存在于整个高温阶段 , 说明 条带 P

23、所代表的嗜热细菌生长的温度范围广 , 在 整个高温阶段(52,64?) 均能生长 , 其测序结果表明与种群 Bacillusniacini有较高的亲缘关系 .在 堆肥的高温阶段嗜热细菌种群结构随温度而变化. 不同温度下存在不同的嗜热细菌优势种群 . 通 过系统发育分析 12 泳道的条带 w 和条带 Y 与数 据库中的种群Clostridiumthermocellum,Cstercorarium有较近的亲缘关系 , 而这 2 个种群属于嗜热厌氧纤维素降解菌中的热纤梭菌和嗜热堆肥梭菌 Il6J.这可能是由于堆肥第12d 为翻堆的间隙 , 堆体局部处于缺氧状态从而有利于厌氧菌群的生长 . 本研究中通

24、过对 DGGE条带切胶测序 分析的细菌绝大部分属于Bacillus.与其他学者研究的堆肥高温阶段嗜热细菌优势种群有一定的差异 , 如杨虹等 I1 研究猪粪高温堆肥 , 筛选出 的主要优势菌群为嗜粪菌 ; 韩如呖等【】从新鲜牛 粪和纤维素降解富集物高温堆肥中分离得到主 要优势菌群为嗜热厌氧纤维素降解细菌 . 这可能是由于所研究的堆肥材料不同 . 本研究所用的引 物为细菌特异性引物 , 为了更全面地反映厨余垃6 期杨朝晖等 : 厨余垃圾高温堆肥中嗜热细菌种群结构分析737圾堆肥高温阶段微生物的多样性, 将进一步研究高温阶段放线菌 , 真菌的种群动态变化 . 【7】 4 结论4.1 厨余垃圾堆肥高温

25、阶段 (>5O?) 时间持续 7d, 最高温度达到了 64?, 高温阶段堆肥样 PCR-DGGE分析和值分析结果显示 , 堆肥高 温阶段有着比较丰富的细菌多样性 , 同时存在明显的优势种群结构变化.4.2DGGE图谱优势条带切胶测序和系统发育分析表明 ,l5条 DGGE优势条带序列中有 l2 条 与芽孢杆菌属 (Bacillus)的嗜热细菌有较近的亲缘关系 ,2 条与梭菌属 (Clostridium) 的嗜热细菌有 较近的亲缘关系 ,1 条与菌种 Symbiobacterium thermophilum 同源性达到 96.7%. 4.3 用 PCR-DGGE技术对厨余垃圾高温堆肥

26、中细菌种群结构和动态变化进行了监测, 结合 DNA测序 , 序列同源性分析和系统发育分析对高温堆肥阶段嗜热细菌作出了种属鉴定. 为厨余垃圾堆肥工艺改进和缩短堆肥周期提供了理论依据 .参考文献 :【 1】 MuyzerG,deWaalEC,UitterlindenAG.Profilingofcomplex microbialpopulationsbydenaturinggradientgelelectrophoresis analysisofpolymerasechainreactionamplifiedgenescodingfor 16SrRNA【 J】 .AppfiedandEnvironm

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