第九章 工业微生物杂交育种

1、第九章 工业微生物杂交育种第一节第一节 微生物杂交微生物杂交一、杂交的意义一、杂交的意义优点：优点：1 1、使两亲株的优良性状集中于重组体内，获得新品种。、使两亲株的优良性状集中于重组体内，获得新品种。2 2、重组体不仅可克服因长期诱变造成的生活力下降，代、重组体不仅可克服因长期诱变造成的生活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性。谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性。3 3、总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促进遗传学、总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促进遗传学理论的发展。理论的发展。二、微生物杂交育种基本程序二、微生物杂交育种基本程序 选择原始亲本选择原始亲本诱变筛选

2、直接亲本诱变筛选直接亲本直接亲本之直接亲本之间亲和力鉴定间亲和力鉴定杂交杂交分离到基本培养基或选择性分离到基本培养基或选择性培养基培养培养基培养筛选重组体筛选重组体重组体分析鉴定重组体分析鉴定 三、杂交过程中亲本和培养基的选择三、杂交过程中亲本和培养基的选择（一）亲本菌株的选择（一）亲本菌株的选择1 1、原始亲本、原始亲本（1 1）具有优良性状：高产、代谢快，产孢子能力强等。）具有优良性状：高产、代谢快，产孢子能力强等。（2 2）具有野生型遗传标记：如孢子颜色等。）具有野生型遗传标记：如孢子颜色等。2 2、直接亲本、直接亲本 直接用于杂交配对的菌株，由原始亲本菌株经诱变剂处直接用于杂交配对的菌

3、株，由原始亲本菌株经诱变剂处理后选出。理后选出。（1 1）性状优良）性状优良（2 2）利于筛选的遗传标记）利于筛选的遗传标记 杂交育种最好采用具有杂交育种最好采用具有明显遗传性状差异大明显遗传性状差异大的近亲菌株的近亲菌株为直接亲本。为直接亲本。（二）培养基（二）培养基完全培养基（完全培养基（CM）：）：天然有机物天然有机物基本培养基（基本培养基（MM）：）：无机化合物无机化合物有限培养基（有限培养基（LM）：）：MM或蒸馏水或蒸馏水10%20%CM补充培养基（补充培养基（SM）：）：MM特定物质特定物质发酵培养基：发酵培养基：适合产物合成的培养基适合产物合成的培养基 培养基（除培养基（除CM

4、）配制所用试剂必须为化学纯以上，）配制所用试剂必须为化学纯以上，有机物也需纯净；器皿也不得含任何有机物。有机物也需纯净；器皿也不得含任何有机物。四、杂交育种的遗传标记四、杂交育种的遗传标记1. 营养缺陷型标记营养缺陷型标记：可选单缺、双缺或多缺型，通常：可选单缺、双缺或多缺型，通常用双缺陷型标记；用双缺陷型标记；2. 抗性标记：抗性标记：抗逆性（耐高温、高盐和高抗逆性（耐高温、高盐和高pH等）和抗等）和抗药性；药性；3. 温度敏感性标记：温度敏感性标记：许可温度下生长，非许可温度下许可温度下生长，非许可温度下不生长。不生长。4. 其他性状标记：其他性状标记：孢子颜色、菌落形态结构、色素等。孢子

5、颜色、菌落形态结构、色素等。五、杂交育种方法五、杂交育种方法1 1、常规杂交育种、常规杂交育种 利用有性生殖、准性生殖、接合、转化、转导、溶利用有性生殖、准性生殖、接合、转化、转导、溶源转换和转染等自然过程完成。源转换和转染等自然过程完成。2 2、原生质体融合育种、原生质体融合育种 酶解破除细胞壁后制备原生质体，然后诱导原生质酶解破除细胞壁后制备原生质体，然后诱导原生质体融合杂交，双亲本不受亲和力限制，甚至可打破种属体融合杂交，双亲本不受亲和力限制，甚至可打破种属间遗传障碍，获得远缘杂交重组体。间遗传障碍，获得远缘杂交重组体。半知菌的准性生殖示意图半知菌的准性生殖示意图在微生物中各种形式基因重

6、组的比较在微生物中各种形式基因重组的比较 重组范围重组范围整套染色体整套染色体局部杂合局部杂合供体和受体间的关系供体和受体间的关系高频率高频率低频率低频率部分染部分染色体色体个别或个别或少数基少数基因因细胞融合或联结细胞融合或联结性细胞性细胞真菌的有真菌的有性生殖性生殖体细胞体细胞真菌的准性生殖真菌的准性生殖细胞间暂时沟通细胞间暂时沟通细菌的细菌的接合接合性性 导导细胞间不接触细胞间不接触吸收游离吸收游离DNADNA片段片段转转 化化噬菌体携带噬菌体携带DNADNA转转 导导由噬菌体提供由噬菌体提供遗传物质遗传物质* *完整噬菌体完整噬菌体溶源转溶源转变变噬菌体噬菌体DNADNA转染转染* *

7、虽不属重组虽不属重组, ,但与转导和转化有某些相似处但与转导和转化有某些相似处, ,可供比较。可供比较。 第二节第二节 细菌杂交育种细菌杂交育种一、细菌繁殖和遗传结构一、细菌繁殖和遗传结构1. 遗传物质：遗传物质：拟核（环状染色体）、拟核（环状染色体）、质粒（质粒（F因子、因子、R因子、因子、col质粒等。质粒等。2. 繁殖方式：繁殖方式：裂殖，细胞数量呈裂殖，细胞数量呈2n级别增加。级别增加。二、细菌杂交的概况和原理二、细菌杂交的概况和原理（一）细菌接合与（一）细菌接合与F F性因子性因子 接合是指两个性别不同的微生物细胞之间接合是指两个性别不同的微生物细胞之间接触接触，遗，遗传物质传物质转

8、移、交换、重组转移、交换、重组，形成一个新个体。，形成一个新个体。 细菌结合时的遗传物质为单向转移，并且要具有性细菌结合时的遗传物质为单向转移，并且要具有性别（别（ F F性因子）。性因子）。a）F-菌株菌株(“雌性雌性”菌株菌株)，不含，不含F因因子，没有性菌毛，但可以通过接合子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收作用接收F因子而变成因子而变成F+菌株；菌株；b）F+菌株菌株(“雄性雄性”菌株菌株)， F因子因子独立存在，细胞表面有性菌毛。独立存在，细胞表面有性菌毛。c c）HfrHfr菌株菌株，F F因子插入到染色体因子插入到染色体DNADNA上上，细胞表面有性菌毛。，细胞表面有性菌毛。d

9、 d）FF菌株菌株，Hfr菌株内的菌株内的F因子因因子因不正常切割而脱离染色体时，形成不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为因子，特称为F因因 子。子。（二）大肠杆菌杂交与菌株类型（二）大肠杆菌杂交与菌株类型1） F+F-杂交杂交2 2）Hfr Hfr F-杂交杂交 Hfr菌株仍然保持着菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有细胞的特征，具有F性菌毛，并象性菌毛，并象F+一样与一样与F-细胞进行接合。细胞进行接合。 所不同的是，当所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，识别而产生缺口后，F因子的先导区因

10、子的先导区(leading region)结合着染色体结合着染色体DNA向受体细胞转移。向受体细胞转移。 F因子除先导区以外，其余绝大部分是处因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此断，因此F因子不易转入受体细胞中。因子不易转入受体细胞中。 HfrF-杂交后的受体细胞杂交后的受体细胞(或接合子或接合子)大多大多数仍然是数仍然是F-。 染色体上越靠近染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。中出现重组子的的时间就越早，频率也

11、高。3 3）FFF-杂交杂交 Hfr菌株内的菌株内的F因子因不正常切割因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的带一小段染色体基因的F因子，特因子，特称为称为F因子。因子。FF-与与F+F-的不同：的不同： 供体的部分染色体基因随供体的部分染色体基因随F一起一起转入受体细胞转入受体细胞a）与染色体发生重组；）与染色体发生重组；b）继续存在于）继续存在于F因子上，形成一种因子上，形成一种部分二倍体；部分二倍体；三、细菌杂交方法与技术三、细菌杂交方法与技术1. 杂交亲本菌株选择、标记菌株和性别菌株的获得杂交亲本菌株选择、标记菌株和性别菌株的获得

12、（1）杂交亲本菌株的获得：）杂交亲本菌株的获得：带有带有选择性标记选择性标记和和非选择性非选择性标记标记；（2）标记菌株：）标记菌株：营养缺陷型；营养缺陷型；（3）性别菌株的获得：）性别菌株的获得： F+菌株：菌株： F+菌株和菌株和 F-菌株合并培养。菌株合并培养。 F-菌株：菌株：把把F+菌株用不足以抑制其生长的低浓度菌株用不足以抑制其生长的低浓度（30g/mL）吖啶橙吖啶橙处理。处理。2. 杂交的方法杂交的方法（1）方法：直接混合法）方法：直接混合法 分别培养至对数期，而后在新鲜肉汤培养液中混合缓分别培养至对数期，而后在新鲜肉汤培养液中混合缓慢振荡培养。培养后在慢振荡培养。培养后在基本培

13、养基基本培养基或选择性培养基上分离或选择性培养基上分离原养型重组体。原养型重组体。（2）反选择标记的应用）反选择标记的应用 A. 营养缺一培养基法：营养缺一培养基法：抑制抑制Hfr菌株菌株 B. 抗药性培养基法：抗药性培养基法：抗性基因非选择性标记的应用抗性基因非选择性标记的应用（3）非选择性标记的应用）非选择性标记的应用第三节第三节 放线菌杂交育种放线菌杂交育种一、放线菌细胞结构与繁殖一、放线菌细胞结构与繁殖1. 细胞结构：细胞结构：基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。2. 繁殖方式：繁殖方式：无性孢子生殖无性孢子生殖二、放线菌杂交概况和原理二、放线菌杂交概况和原理（一）

14、放线菌杂交原理（一）放线菌杂交原理 类似于大肠杆菌，但有些放线菌杂交过程中会形类似于大肠杆菌，但有些放线菌杂交过程中会形成成异核体异核体，两种情况：两种情况： 1. 异核体（染色体不发生交换）异核体（染色体不发生交换）2. 部分结合子（染色体发生交换）部分结合子（染色体发生交换） 放线菌的杂交只发生在具有一定感受态的菌株之间。放线菌的杂交只发生在具有一定感受态的菌株之间。（二）放线菌杂交过程（二）放线菌杂交过程1. 1. 接合：混合培养接合：混合培养 部分结合子：一个供体细胞的部分染色体和一个受体细部分结合子：一个供体细胞的部分染色体和一个受体细胞整套染色体相结合，共同存在于一个细胞中。胞整套

15、染色体相结合，共同存在于一个细胞中。2. 2. 杂合系和重组体杂合系杂合系和重组体杂合系 杂合系菌落很小，能在选择性培养基和基本培养杂合系菌落很小，能在选择性培养基和基本培养基上生长。杂合系上产生的分生孢子绝大部分都是属基上生长。杂合系上产生的分生孢子绝大部分都是属于双亲本分离子。重组体数量极少。于双亲本分离子。重组体数量极少。 3. 3. 重组体重组体 由杂合系或重组体杂合系进一步繁殖，染色体几由杂合系或重组体杂合系进一步繁殖，染色体几次交换后。次交换后。三、放线菌的杂交技术三、放线菌的杂交技术（一（一) ) 混合培养法混合培养法1. 1. 直接亲本是杂交配对菌株（遗传标记）直接亲本是杂交配

16、对菌株（遗传标记） 如如A A（metmet- -，phephe- -，strstr+ +），），B B（hishis- -，uraura- -）2. 2. 斜面混合接种斜面混合接种3. 3. 单孢子悬液的制备单孢子悬液的制备4. 4. 重组体的检出（选择性培养基）重组体的检出（选择性培养基） （1 1）原养型重组体（产量）：基本培养基）原养型重组体（产量）：基本培养基 （2 2）异养型重组体（遗传学理论研究）：选择性培养基）异养型重组体（遗传学理论研究）：选择性培养基5. 5. 杂合系分析（影印法）杂合系分析（影印法）（二）（二） 玻璃纸法玻璃纸法 1. 1. 玻璃纸法原理玻璃纸法原理 2.

17、 2. 玻璃纸平板杂交的具体方法玻璃纸平板杂交的具体方法 3. 3. 分离子的检出和鉴别分离子的检出和鉴别（三）（三） 平板杂交法平板杂交法 该法适合大量菌落与一个共同试验菌株配对测定该法适合大量菌落与一个共同试验菌株配对测定致育能力。致育能力。第四节第四节 酵母菌的杂交育种酵母菌的杂交育种一、酵母菌的细胞结构和菌落形态一、酵母菌的细胞结构和菌落形态 酵母菌一般指能发酵糖类的各种单细胞真菌。酵母菌一般指能发酵糖类的各种单细胞真菌。个体个体一般以单细胞状态存在。多数营出芽繁殖。能发酵糖类一般以单细胞状态存在。多数营出芽繁殖。能发酵糖类产能，细胞壁常含甘露聚糖。常生活在含糖量较高、酸产能，细胞壁常

18、含甘露聚糖。常生活在含糖量较高、酸度大的水生环境中。度大的水生环境中。二、酵母菌的生活史和繁殖方式二、酵母菌的生活史和繁殖方式三、酵母菌的杂交三、酵母菌的杂交（一）标记菌株的选择：（一）标记菌株的选择：营养缺陷型或抗性突变标记营养缺陷型或抗性突变标记（二）酵母杂交方法（二）酵母杂交方法 1. 子囊孢子的制备子囊孢子的制备：饥饿培养获得子囊孢子，采用蜗：饥饿培养获得子囊孢子，采用蜗牛酶或匀浆法破除子囊壁。牛酶或匀浆法破除子囊壁。 2. 杂交：杂交：哑铃状的接合子哑铃状的接合子第五节第五节 霉菌杂交育种霉菌杂交育种一、霉菌的细胞结构和繁殖一、霉菌的细胞结构和繁殖 1. 霉菌细胞的结构：霉菌细胞的结

19、构：真核生物，菌丝分支状，分为基真核生物，菌丝分支状，分为基质菌丝和气生菌丝。质菌丝和气生菌丝。 2. 霉菌的繁殖：霉菌的繁殖：无性繁殖和准性繁殖。无性繁殖和准性繁殖。二、霉菌杂交的原理和杂交技术二、霉菌杂交的原理和杂交技术（一）异核体的形成和获得方法（一）异核体的形成和获得方法 异核体：异核体：两株两株基因型不同的菌株菌丝体在培养过程中紧基因型不同的菌株菌丝体在培养过程中紧密接触，接触部分细胞壁溶解、联结、融合、细胞质交流，密接触，接触部分细胞壁溶解、联结、融合、细胞质交流，在共同的细胞质里存在着在共同的细胞质里存在着两个细胞核两个细胞核。 异核体营养互补：异核体营养互补：两细胞核在同一细胞

20、质内两细胞核在同一细胞质内 喂养、互养：喂养、互养：两菌株十分靠近，营养物质渗透到培养基两菌株十分靠近，营养物质渗透到培养基内互相补充。内互相补充。（一）异核体的形成和获得方法（一）异核体的形成和获得方法1. 选择直接亲本选择直接亲本 选择选择亲和力强亲和力强又携带又携带明显营养标记明显营养标记和和辅助标记辅助标记的菌的菌株作为杂交直接亲本。株作为杂交直接亲本。 衔接法衔接法或或混合法混合法测定亲和力。测定亲和力。2. 异核体形成的方法异核体形成的方法（1）完全培养基的混合培养法）完全培养基的混合培养法 配对菌株孢子混合接种于液体完全培养基中，长出年配对菌株孢子混合接种于液体完全培养基中，长出

21、年轻菌丝后撕碎摊布于基本培养基平板上，挑取异核体菌丝轻菌丝后撕碎摊布于基本培养基平板上，挑取异核体菌丝丛上的孢子。丛上的孢子。（2）基本培养基衔接法）基本培养基衔接法 蘸取孢子相向划线，部分衔接。蘸取孢子相向划线，部分衔接。（3）有限培养基培养法）有限培养基培养法 有限培养基液体培养长出菌丝后撕碎摊布于基本培养有限培养基液体培养长出菌丝后撕碎摊布于基本培养基平板上。基平板上。异核体的检出异核体的检出 在基本培养基平板上长出的菌丝丛，在基本培养基平板上长出的菌丝丛，异核体菌丝、异核体菌丝、同核菌丝、互养菌丝同核菌丝、互养菌丝混杂在一起，要进行复证。混杂在一起，要进行复证。 方法：方法：将以上菌丝

22、单独一条一条地挑取置于基本培养基上，将以上菌丝单独一条一条地挑取置于基本培养基上，能重新形成菌落的即为能重新形成菌落的即为异核菌株异核菌株。A. 把异核体菌落上的把异核体菌落上的分生孢子分生孢子涂布到基本培养基上。涂布到基本培养基上。观察孢子的颜色（类似野生型孢子颜色）观察孢子的颜色（类似野生型孢子颜色）1. 杂合二倍体的形成和诱发杂合二倍体的形成和诱发 两单倍体亲株融合，形成两单倍体亲株融合，形成异核体细胞，细胞融合，可以异核体细胞，细胞融合，可以形成形成纯合二倍体纯合二倍体和和杂合二倍体杂合二倍体。 异核体内自发核融合而形成异核体内自发核融合而形成杂核二倍体的频率极低，人工杂核二倍体的频率

23、极低，人工诱变，以诱变，以天然樟脑蒸汽熏蒸天然樟脑蒸汽熏蒸或或紫外线照射紫外线照射可以促进核融合。可以促进核融合。（二）杂合二倍体的形成和检出（二）杂合二倍体的形成和检出2. 杂合二倍体的表型杂合二倍体的表型 作为标记的突变基因一般都是隐性的，杂合二倍体的作为标记的突变基因一般都是隐性的，杂合二倍体的表型与野生型相似。表型与野生型相似。3. 杂合二倍体的检出杂合二倍体的检出（1）杂合二倍体在异核体菌落上以）杂合二倍体在异核体菌落上以角变角变或或斑点斑点形态形态（区别于异核体）出现，可挑取其上的分生孢子。（区别于异核体）出现，可挑取其上的分生孢子。（2）菌丝撕碎分离培养于基本培养基平板上。）菌丝

24、撕碎分离培养于基本培养基平板上。（三）体细胞交换、分离和单倍化（三）体细胞交换、分离和单倍化1. 体细胞交换体细胞交换 杂合二倍体在细胞分裂过程中染色体在四线期发生杂合二倍体在细胞分裂过程中染色体在四线期发生交换而产生部分标记现象。交换而产生部分标记现象。2. 体细胞分离体细胞分离 杂合二倍体的无性繁殖后子代中，由于隐性基因同杂合二倍体的无性繁殖后子代中，由于隐性基因同质状态的出现而表现出隐性性状的现象，可产生多种类质状态的出现而表现出隐性性状的现象，可产生多种类型的分离子。型的分离子。3. 单倍化单倍化 杂合二倍体在增殖过程中，基因借助整条染色杂合二倍体在增殖过程中，基因借助整条染色体的随机交换而得到单倍重组体或单倍的亲本分体的随机交换而得到单倍重组体或单倍的亲本分离子。离子。4. 分离子分离子 杂合二倍体经过体细胞交换和单倍化后产生的子细胞。杂合二倍体经过体细胞交换和单倍化后产生的子细胞。 根据表型或细胞核内染色体的倍性情况可对分离子进行不同根据表型或