α-干扰素与异搏定逆转肝癌细胞耐药性的研究

1、    -干扰素与异搏定逆转肝癌细胞耐药性的研究        肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药(MDR)是肿瘤化疗失败的主要原因。异搏定(VPL)是最早被发现可逆转MDR的化合物，但VPL体外逆转MDR所需浓度较高，因而限制了它在临床中应用。本实验选择VPL和IFN-联合进行逆转，以观察二者是否有协同作用。 材料和方法一、材料人肝癌细胞耐药株SMMC-7721/ADM是本实验室对SMMC-7721长期用阿霉素诱导、筛选所建立的耐药株；阿霉素为Sigma公司产品；柔红霉素为Fa

2、rmitatia公司产品；异搏定为上海天丰药厂产品；-干扰素为沈阳三生制药股份有限公司产品。P-糖蛋白单克隆抗体MRK16由Dr.T.Tsuruo赠送。二、方法(一) VPL逆转SMMC-7721/ADM细胞药物敏感性测定：取对数生长期SMMC-7721/ADM细胞，接种于96孔平底培养板中，加入不同浓度的异搏定，然后分别加入阿霉素、柔红霉素(浓度均为1.5g/ml)。培养结束后，每孔加入二甲亚砜150l，终止反应，然后用酶联免疫检测仪检测OD值(光密度)，计算细胞存活率。根据直线回归与相关，分析异搏定浓度的变化与细胞存活率的关系。(二) 流式细胞技术检测细胞MDR1表达产物P-gp：用流式细

3、胞仪进行膜抗原P-gp测定。分别检测SMMC-7721、SMMC-7721/ADM、SMMC-7721/ADM+VPL细胞膜抗原P-gp表达。(三) 流式细胞技术检测细胞内药物浓度：将SMMC-7721/ADM与SMMC-7721细胞接种于24孔的培养板中，细胞分成4组：敏感组、耐药组、VPL逆转组、VPL与INF-联合逆转组。第四组加入INF-(浓度500u/ml)，其它三组无INF-，37、5%CO2培养箱中孵育24小时，次日4组均加入柔红霉素(1g/ml)，在加入柔红霉素前1小时，第3、4组加入VPL(2.5g/ml)，2小时后流式细胞仪分析细胞荧光强度。结果一、异搏定对SMMC-772

4、1/ADM抗药性的影响由表1可见，随异搏定浓度增加，耐药细胞的吸光度值，活细胞的百分数随着降低，实验组与对照组比较差异有非常显著性(P<0.01)。VPL处理前，0.15g/ml的阿霉素和柔红霉素几乎没有杀伤SMMC-7721/ADM细胞的作用。VPL处理后，化疗药物杀伤SMMC-7721/ADM细胞的作用增强。实验组与对照组比较：P<0.01二、异搏定与-干扰素联合对SMMC-7721/ADM抗药性影响由表2可见，-干扰素与异搏定联合逆转SMMC-7721/ADM与异搏定单独逆转SMMC-7721/ADM细胞比较，细胞存活率有明显不同。ADM浓度为0.15g/ml,VPL以g/m

5、l为单位，INF-浓度为500u/ml三、异搏定逆转耐药细胞前后细胞表面P-gp表达流式细胞分析SMMC-7721/ADM细胞膜上P-gp荧光细胞染色率(%)为70.13，较敏感细胞有非常明显的升高(0.65)，VPL逆转SMMC-7721/ADM细胞后，细胞表面P-gp的表达较塑转前有明显降低(22.68)。四、逆转前后细胞内柔红霉素的比较由表3可见，耐药细胞内DNR积聚能力较敏感细胞明显降低，VPL逆转SMMC-7721/ADM后，细胞内DNR浓度有所提高。VPL与IFN-联合作用于SMMC-7721/ADM细胞后，细胞内DNR浓度进一步提高。DNR浓度为1.5g/ml，VPL为2.5g/

6、ml，IFN-为500u/ml，P值是以SMMC-7721/ADM细胞组为对照。表1不同浓度异搏定对SMMC-7721/ADM细胞(0.15g/ml)抗药性影响分别异搏定g/mlSMMC-7721/AMD+ADM吸光度X1活细胞(%)对照00.9410012.50.616525.00.5862310.00.4750420.00.3739表2异搏定与-干扰素联合对SMMC-7721/ADM抗药性影响分别SMMC-7721/ADM+INF-SMMC-7721/ADM-INF-t检验吸光度活细胞数(%)吸光度活细胞数(%)t值P值ADM0.86±0.013910.94±0.577

7、1006.5320<0.05ADM+0.25VPL0.86±0.013870.85±0.017946.9420<0.05ADM+0.5VPL0.71±0.020760.81±0.0153868.1650<0.02ADM+2.5VPL0.29±0.056310.62±0.0305669.7756<0.02表3SMMC-7721/ADM及VPL与IFN-逆转SMMC-7721/ADM前后细胞内柔红霉素的比较细胞平均DNR浓度阳性细胞数(%)p值SMMC-721121097.5SMMC-7211/ADM13362.3

8、SMMC-7211/ADM+VPL16376.1<0.05SMMC-7211/ADM+VPL+-干扰素19590.6<0.005讨论 为了筛选有效的抗药逆转剂，我们用异搏定(VPL)和-干扰素(IFN-)进行肝癌细胞耐药性逆转的研究，以便为临床提供有效的逆转方法。一、异搏定逆转SMMC-7721/ADM的作用VPL是一种钙通道阻滞剂，是最早发现具有逆转MDR的逆转剂1。本实验发现随着异搏定浓度增加，抗癌药物的细胞毒性逐渐递增，VPL对SMMC-7721/ADM的逆转作用与VPL浓度呈剂量效应关系。VPL逆转耐药的机制，本实验发现：SMMC-7721/ADM细胞膜P-gp表达在VPL

9、逆转前后有显著不同，细胞内DNR相对浓度也不同，推测VPL与SMMC-7721/ADM细胞膜上的P-gp结合后，抑制了细胞毒药物的外排，使化疗药物细胞内浓度升高，细胞毒效应增强。与Akihiro等的结果一致2。二、异搏定与干扰素联合逆转SMMC-7721/ADM的作用由于VPL的逆转作用与本身的浓度呈剂量效应关系，在达到有效抑制MDR的血清浓度时，就会造成明显的心脏毒性作用。本实验用异搏定与IFN-联合逆转MDR，结果发现：加入IFN-后，VPL为2.5g/ml浓度时，几乎与VPL 20g/ml单独逆转时的效果相当，VPL与IFN-二者联合，有明显的协同作用。Yuan等人的实验证实IFN-单独

10、使用不能逆转耐药细胞对阿霉素的耐受，它可能通过对P-gp的直接作用而不是竞争P-gp上的药物结合点3。对于IFN-是直接作用于P-gp，还是使VPL与化疗药物的竞争性增强，其机制尚有待进一步探讨。总之IFN-毒副作用小，可降低VPL逆转MDR的剂量，是一个有前途的耐药逆转剂。作者单位：210009南京铁道医学院附属医院参考文献1.Mohammad R.Abbaszadegan.Nils E.Foley.Mary C.Gleason-Guzman and William S.Dalton.Resistance to the Chemosensitizer Verapamil in a Multi

11、-drug-resistan (MDR) Human Multiple Myeloma Cell Line.Int.J.Cancer,1996,66:506-5142.Akihiro Takeshita.Kaori Shinjo.Kazunori Ohnishi,and Ryuzo Ohno.New Flow Cytometric Method for Detection of Minimally Expressed Multidrug Resistance P-Glycoprotein on Normal and Acute Leukemia Cells Using Biotinylated MRK16 and Streptavidin-RED 670 Conjugate.Jpn.J.Cancer Res,1995,86:607-6153.Yuan Kang and Roger