芍药苷对血吸虫病肝肉芽肿及纤维化细胞信号转导的干预

1、沈继龙的国家自然基金标书（2005年）芍药苷对血吸虫病肝肉芽肿及纤维化细胞信号转导的干预（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）：1. 项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。）血吸虫病是热带亚热带发展中国家的严重寄生虫病。据世界卫生组织（WHO）报道，该病在全世界74 个国家中流行，6 亿多人口受到威胁，2 亿多人受到感染，其中1.2 亿伴有临床症状，2000 万伴有严重后遗症；全世界每年死于血吸虫病性肝纤维化及其并发症的患者达50 万-100 万；血吸虫病在14 岁以下的儿童中发病率之高，严重影响了儿童的智力发育和身心健康1。现已发现有6 种血吸虫引起

2、人类疾病，我国是日本血吸虫病流行最严重的国家2。该病主要分布于我国长江流域及其南部的12 个省（区、市），受威胁的人群达1 亿以上，感染人数超过1000 万2。目前，我国日本血吸虫病的流行尚未得到有效控制，湖区患病人数急剧增加。该病已成为严重影响我国人民身心健康和国民经济、社会发展和稳定的主要疾病之一2。血吸虫病是一种虫卵肉芽肿引起的慢性免疫性疾病，其病理基础是沉积于组织内大量的成熟虫卵对机体的刺激、宿主对活毛蚴分泌的可溶性抗原产生的病理性免疫应答，并形成虫卵肉芽肿和继发肝纤维化的形成2。肝纤维化是血吸虫病严重的后果，它可进一步导致门静脉高压症如食管胃底静脉曲张、脾肿大和脾功能亢进，最后引发上

3、消化道大出血导致死亡2。日本血吸虫病肝纤维化/肝硬化及其并发症是血吸虫病患者死亡的主要原因3。根据以上的发病机理和病理进程，针对日本血吸虫病的治疗应包括杀虫，抑制虫卵肉芽肿，减轻、延缓甚至阻止纤维化形成等三个关键环节。目前国内外治疗血吸虫病主要采用杀虫疗法（即第一环节），尤其是首选吡喹酮为抗血吸虫病药物2, 4，因此，这就产生了以下问题：第一，吡喹酮只对童虫、成虫和组织内成熟虫卵具有杀灭作用，所以，杀虫治疗后肝脏及肠壁组织内未成熟虫卵仍可继续发育，组织虫卵肉芽肿反应仍在继续5, 6；第二，由于慢性患者（此类患者在血吸虫感染者中占大多数）临床上多无症状或只表现为慢性腹泻而易延误诊断2，结果往往不

4、能及时使用杀虫药，导致肝肉芽肿和纤维化的形成；第三，近年国外已从经有效剂量吡喹酮治疗曼氏血吸虫病未愈的感染者中分离出抗药株7。由于药物压力，日本血吸虫同样存在抗药株产生的可能性；第四，对于已形成的虫卵或纤维化，杀虫疗法也无能为力4；此外，有报道，日本血吸虫国家自然科学基金申请书第 6 页 版本1.011.418病患者在彻底杀虫治疗后肝纤维化仍可继续发展8, 9。因此，杀虫治疗后，使用针对肉芽肿免疫调节和抗纤维化的药物治疗显得更加迫切。但因为目前对虫卵肉芽肿形成以及由此引起纤维化的机制了解很少，所以，尚未成功研发出针对这两个环节、疗效确切、副作用少的化学药物2, 4。研究虫卵肉芽肿形成以及由其引

5、起纤维化的机制，研发疗效明确、副作用少，能直接抑制血吸虫虫卵肉芽肿形成、减轻或延缓纤维化的药物对降低血吸虫病发病率、提高生存质量、治疗病人、降低死亡率都具有十分重要的意义。日本血吸虫虫卵肉芽肿的形成与细胞及体液免疫有关，尤其是前者在肉芽肿形成早期起主要作用2。血吸虫尾蚴通过疫水经皮肤感染人体，先后经过童虫、成虫阶段，最后主要移行于肝门静脉和肠系膜静脉并寄生、产卵。虫卵随血流主要沉积于门静脉分支、肝血窦前，在此，虫卵内成熟的毛蚴分泌可溶性虫卵抗原（soluble egg antigen,SEA）并经卵壳上的微孔渗入肝周围组织。SEA 被周围组织中的巨噬细胞吞噬处理，经过处理的抗原被递呈到辅助性的

6、T 淋巴细胞（Th）。同时，摄取了抗原的巨噬细胞释放白细胞介素1（IL-1），激活TH，后者产生多种细胞因子，其中促进肉芽肿形成的有IL-1、IL-2 、IL-4 、IL-5、IL-13 等；抑制肉芽肿形成的有IL-10、IL-2、IFN- 等；还有各类细胞趋化因子、移动抑制因子等。在上述各种细胞因子的共同参与下，大量巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞、成纤维细胞和嗜酸粒细胞等聚集到虫卵周围形成炎性肉芽肿，随后肉芽肿中心坏死，形成嗜酸性脓肿，卵内毛蚴逐渐死亡，SEA 分泌量减少，最终停止，肉芽肿退化并开始局部纤维化，由此可引出严重临床症状2, 4。在这些细胞因子中，IL-4、IFN- 在日

7、本血吸虫肉芽肿的形成和发展中起重要作用2, 10。IL-4 由Th2细胞产生，能促进Th2 细胞自身的增殖、分化并刺激自身和其它Th2 细胞分泌IL-5，而IL-5 通过刺激嗜酸粒细胞（EOS）增殖、分化而促进肉芽肿的炎性反应；IL-4 能诱导单核细胞分泌克隆刺激因子、促进巨噬细胞分化、促进淋巴细胞侵润而增强肉芽肿炎性反应； IL-4 通过刺激B 淋巴细胞增殖分化并产生IgE、IgG，而介导肉芽肿形成；此外，IL-4 可抑制Th1 细胞增殖，并下调Th1 细胞在肉芽肿炎性反应中的作用。IFN- 由Th1细胞产生，能抑制Th2 细胞增殖和IL-4、IL-5 产生，从而减轻肉芽肿炎症，此外IFN-

8、还抑制、型胶原转录而减轻纤维化等。总之，在血吸虫感染早期，肉芽肿形成过程中，多种细胞因子均有增加，它们之间相互作用形成一个及其复杂的网络。这些细胞因子的综合作用调控着肉芽肿形成及以后纤维化的发生、发展。下调促进肉芽肿形成细胞因子和/或上调抑制肉芽肿形成细胞因子的表达，是控制肉芽肿形成的一个理想途径。国家自然科学基金申请书第 7 页 版本1.011.418虽然目前对于血吸虫性肝纤维化的发生机制尚不清楚，但国际上对非血吸虫病性肝纤维化的发生机理研究较多，也较明确。肝纤维化是指肝脏纤维组织过度沉积，是纤维增生和分解不平衡的结果。反复或持续的慢性肝实质炎症、坏死，可使细胞外基质（extracellul

9、ar matrix, ECM），主要为胶原纤维，合成过多而降解相对不足，从而形成肝纤维化，它是肝硬化的必经阶段4。肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）目前被公认为是ECM 的主要来源细胞，HSC 的激活是肝纤维化形成初始的中心环节4, 11。所以，研究HSC 的激活对探索血吸虫病肝纤维化发生机理及肝纤维化的有效预防均有特别重要的现实意义。HSC 的激活是一个级联反应过程，其过程如下4, 12：当肝脏受到各种损伤时，局部的肝细胞、枯否细胞（巨噬细胞）、窦内皮细胞、血小板、淋巴细胞、中性粒细胞等释放多种细胞因子，其中最主要的是血小板源性生长因子（platel et-d

10、erived growthfactor, PDGF）和转化生长因子（transforming growth factor-1 ,TGF1）等，它们共同作用于HSC，使其激活。被激活的HSC 向肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）转化，同时表达大量的平滑肌肌动蛋白（-Smooth muscle actin,-SMA）、多种细胞因子受体（例如PDGF 受体和TGF1 受体等）、以及、型胶原等ECM 成分；并且被激活的HSC 自身又激活 基因结合核因子（nuclear factor-gene-binding,NFB）、分泌TGF1 等细胞因子。此外，ECM 中的型胶原等成分也可激活HS

11、C。因此，一旦HSC 被激活，受细胞旁分泌、自分泌的直接作用及所处环境胶原的间接作用，HSC活化将逐渐放大并持续存在，即使除去诱因，活化也将继续下去4。HSC 的激活主要是因为某些细胞因子作用于该细胞的信号转导通路所致，在这些细胞因子中，研究的最多，也最重要的是PDGF 和 TGF14, 13, 14因子。PDGF 为HSC 最强的促分裂剂4。枯否细胞（巨噬细胞）是主要合成PDGF 的细胞。肝脏受损时，枯否细胞、血小板、窦内皮细胞及激活的HSC 均可以分泌PDGF4。当其与PDGF 受体（为酪氨酸蛋白激酶受体）结合时，促使受体形成二聚体而被激活，随后受体的酪氨酸残基发生自身磷酸化，继而先后激活

12、Ras、Raf-1、MAPK(mitogen-activatedprotein kinase)激酶、ERK（extracellular signal-regulated kinase）。ERK 向核内转位，促进有关转录因子磷酸化及基因表达而引起HSC 的活化、增殖4。国家自然科学基金申请书第 8 页 版本1.011.418TGF1 是一种对细胞生长、分化和多种生理、病理过程起重要调节作用的细胞因子。在肝受损时，TGF1 由枯否细胞、淋巴细胞、窦内皮细胞及激活的HSC 等合成，能促进HSC 的增殖和基因表达、抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）合成

13、、促进基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitors of MMPs, TIMPs）合成、阻滞ECM 的降解、促进ECM（例如，、型胶原）的生成。此外，TGF1 还能增加PDGF对HSC 的增殖作用，故TGF1被认为是最强的促胶原生成因子，在肝纤维化的发生、发展过程中发挥关键作用4, 13。TGF1 通过细胞内信号转导通路发挥作用，而Smads 是迄今为止发现的TGF1 惟一作用底物4，故TGF1-Smads 信号通路对HSC 激活、ECM 产生的影响引起极大关注。Smads 是线虫Sma 蛋白以及果蝇Mad 蛋白具有同源性的蛋白家族，他们可以将TGF1信号直接由细胞膜受体（为

14、丝/苏氨酸受体）传导入细胞核内。根据Smads 功能不同分为三类：第一类是膜受体激活的Smad (R-Smads)，包括Smad2、3 等，它们可与TGF1受体直接作用，并被磷酸化，之后与Smad4 结合，转位入核以调节靶基因转录；第二类是通用Smad (co-Smad)，目前只有Smad4；第三类是Smad7 等，为TGF1-Smad 信号转导通路的抑制因子，可与R-Smads 竞争性地结合受体，阻止R-Smads 的磷酸化，从而阻断TGF1 的效应。 进入细胞核内的 Smads 复合物可与不同的转录活化因子或转录抑制因子结合而调节TGF1 的生物效应4, 13。总之，因为PDGF、TGF1

15、-Smad 信号转导通路在肝纤维化发病中起着举足轻重的作用，干预这些信号通路就成为肝纤维化防治的理想选择。如前所述，HSC 活化时伴有NFB 激活，而NFB 是一种重要的抗凋亡基因转录因子15, 16。当HSC 处于静息状态时，NFB 与其抑制蛋白结合，不表现活性，当HSC 被激活后，NFB 与其抑制蛋白解离而移位入核，诱导产生一组基因产物，它们的协同作用能抑制TNF- 诱发的caspase-8 激活从而抑制HSC 的凋亡，使HSC 持续活化17, 18。此外，B 细胞淋巴瘤/白血病-2 蛋白（B-cell lymphoma/leukemia-2protein，Bcl-2）家族的成员是细胞凋亡

16、的主要调节因子19。Bcl-2 蛋白家族细胞凋亡抑制因子有:Bcl-2、Bcl-XL 等；细胞凋亡促进因子有:Bax 等。有实验显示20，给予抗肝纤维化的药物，可以使激活的HSC 中的Bcl-2/Bax 比率下调，从而促进HSC 凋亡。所以，通过抑制NF-B活性以及下调Bcl-2/Bax 比率来增加HSC 凋亡,可能成为肝纤维化治疗的新的靶点之一。国家自然科学基金申请书第 9 页 版本1.011.418HSC 活化后还表达多种MMPs、TIMPs，从而调节ECM 的成分和含量，使纤维化不断持续发展。MMPs 是一组锌蛋白酶，共有5 类不同的酶蛋白分子，包括胶原酶（MMP1、MMP8、MMP13

17、）、明胶酶（MMP2、MMP9）、基质分解素（MMP3、MMP10、MMP11）等5 类，它们能水解ECM 中的多种成分，例如，其中的胶原酶水解ECM 中的、型胶原；TIMPs是MMPs 天然的体内抑制因子，包括TIMP-1TIMP-4，它们与活化的MMPs 分子以11的比例结合，抑制MMPs 活性4，尤其是TIMP-1 在调节胶原水解中起重要作用21。此外，TIMP-1 还能抑制活化的HSC 凋亡22。显然，通过抑制TIMP-1 即可以增加ECM 中、型胶原的水解，又可以促进HSC 凋亡。所以，抑制TIMP-1 将可能成为肝纤维化治疗的又一新的靶点。以上主要是关于血吸虫虫卵肉芽肿与细胞因子免

18、疫调节的关系，以及非血吸虫病性肝纤维化发生的机理。但血吸虫病（尤其是日本血吸虫病）性肝纤维化发生机理如何，至今知之甚少。例如，虫卵肉芽肿早期淋巴细胞、枯否细胞（巨噬细胞）、嗜酸粒细胞等分泌的细胞因子是否作为始动因子促进后续的肝纤维化的进程？是否也存在HSC 的激活、增殖？从整体、细胞、蛋白质、和核酸分子水平上了解日本血吸虫病肝纤维化的发生机理是本项目研究内容之一。中医认为，肝纤维化主要因“气滞血瘀”所致，治疗上应以活血化瘀、疏肝理气、抗炎保肝为主4。而赤芍具有活血化瘀功效，白芍具有养血保肝、抗炎止痛等作用23, 24，所以，临床治疗肝纤维化中药方剂中，有不少含有赤芍、白芍成分4。我们近年来研究

19、发现，白芍总苷（为白芍的有效部位，其中芍药苷含量占70%以上）通过清除自由基及减少TGF1 的生成，对抗人白蛋白所致的免疫性大鼠肝纤维化；此外，白芍总苷可以明显抑制佐剂性关节炎大鼠膝关节巨噬细胞样滑膜细胞的IL-1 分泌，并且抑制成纤维样滑膜细胞内MAPK 信号通路中ERK 等的磷酸化、减弱成纤维样滑膜细胞的增殖。总之，白芍总苷通过对T 细胞、B 细胞、巨噬细胞、滑膜成纤维细胞以及自由基、IL-1 、IL-2等的影响而发挥其抗炎、保肝、抗肝纤维化、以及双相免疫调节等作用。赤芍（Radix Paeoniae Rubra）和白芍（Radix Paeoniae Alba）均取材于中药芍药（Paeon

20、ia lactiflora Pall.）根23。芍药苷（paeoniflorin）是芍药根的提取物，也是白芍和赤芍的主要活性单体成分24。芍药苷分子结构式为：国家自然科学基金申请书第 10 页 版本1.011.418其分子式为：C23H28O11 ；分子量为：480.45；熔点：196，毒性极低，具有抗炎25, 26、抑制血小板凝聚、镇痛26、抗过敏25、免疫调节27等作用。有报道，芍药苷通过诱导某些淋巴细胞凋亡、改变淋巴细胞亚群分布来发挥其抗炎及免疫调节等作用28；此外，芍药苷还通过保护肝细胞，同时抑制肝细胞分泌型胶原等ECM 成分来发挥抗肝纤维化作用29。但芍药苷在虫卵肉芽肿形成的早期，如

21、何通过免疫调节作用，抑制或降低炎性反应的强度；而在肝纤维化形成的早期，又如何干预HSC 的信号转导、影响HSC 的凋亡，减轻或延缓纤维化的形成，国内外尚未见报道。研究药物在这些方面的作用机制，对于减轻血吸虫病的肝脏损害，抑制杀虫治疗后肝脏持续纤维化过程，具有十分重要的意义。所以，研究中药芍药苷对虫卵肉芽肿炎性反应的影响，及其对肝纤维化的作用机制是本项目研究内容之二。参考文献：1. World Health Organisation. WHO fact sheet on schistosomiasis.WHO,Geneva.1996.2. 赵蔚先, 高淑芬, 主编: 实用血吸虫病学. 北京: 人

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35、金申请书第 13 页 版本1.011.418162-72.29. 于世瀛, 贲长恩, 白锦雯, 杨美娟, 赵丽云: 芍药苷对离体培养纤维化后肝细胞的定量细胞化学研究. 中国组织化学与细胞化学杂志， 1995; 4(4): 356-360.2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。（此部分为重点阐述内容）（1）研究内容：本项目以芍药苷作用于日本血吸虫病肝脏肉芽肿小鼠模型，主要研究内容为： 制备ICR 株小鼠日本血吸虫病肝虫卵肉芽肿和肝脏纤维化模型；观察药物治疗前后小鼠肝组织大体以及光、电镜下肉芽肿和肝纤维化的形态学改变；肝组织虫卵计数、肝虫卵肉芽肿大小及数量检测；肉芽肿内嗜酸性粒细胞计

36、数；肝纤维化染色及纤维化程度判断；HSC 观察；细胞凋亡小体观察； 用免疫组织化学法检测芍药苷治疗前后肝组织中IL-4、IFN-、TGF1 及其受体、PDGF 及其受体、NFB、Bcl-2、Bax 、MMP13、TIMP1 表达情况； 肝组织HSC 分离、培养；用流式细胞术检测小鼠HSC 凋亡；检测小鼠HSC 中的Smad3、Smad7 以及ERK 表达；用RT-PCR 法检测芍药苷治疗前后小鼠HSC 中、型胶原mRNA表达情况；通过上述实验观察和检测，围绕虫卵肉芽肿形成、HSC 激活、凋亡和胶原产生的过程，探讨芍药苷对血吸虫虫卵肉芽肿以及肝纤维化的作用机制。（2）研究目标： 探讨细胞因子对日

37、本血吸虫虫卵肉芽肿免疫调节作用； 阐明肝纤维化过程中参与纤维化形成的HSC 信号转导的分子机制； 研究芍药苷对虫卵肉芽肿炎性反应的免疫调节； 研究芍药苷对肝纤维化细胞信号转导的干预。(3) 拟解决的关键问题:国家自然科学基金申请书第 14 页 版本1.011.418本项目通过芍药苷对小鼠血吸虫虫卵肉芽肿炎性细胞因子网络调节，对肝纤维化中HSC 激活、凋亡信号通路中的信号分子、凋亡因子的作用，以及对MMPs、TIMPs、型胶原表达的影响，从而阐明芍药苷对虫卵肉芽肿及肝纤维化的作用机制，为研发抗血吸虫肉芽肿及抗血吸虫病肝纤维化新药提供理论和实验根据。3、拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法

38、、技术路线、实验手段、关键技术等说明）研究方案：（1）健康ICR 株小鼠600 只，雌雄各半，随机分成6 组：正常对照组、模型对照组、生理盐水组、低剂量药物组、中剂量药物组、高剂量药物组，每组100 只。除正常对照组以外，其余各组均被制成血吸虫病肝纤维化模型；（2）制作ICR 株小鼠血吸虫病肝纤维化模型：以日本血吸虫尾蚴405 条经腹部皮肤感染小鼠，常规饮食于并感染后第4 周给药，第6、7、8、12、16 周从每组中随机捉拿20 只小鼠，其中10 只立即处死，称量肝脏，留取肝组织标本待测，另10 只作肝组织的分离、培养；（3）镜下观察上述各组小鼠肝组织形态学改变： 取1 克肝组织，常规固定、石

39、蜡切片、HE 染色，在普通光镜下观察肝的病理组织学改变情况并摄片；取1 3 大小肝组织，固定、脱水、包埋、烤干、切片，在透射电镜下观察并摄片（注意观察凋亡小体的形态及数量）； 虫卵肉芽肿大小、数量检测：以此作为肉芽肿炎性反应程度的一个指标。取1 克肝组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，切片厚约45m，HE 染色。应用医学图像分析系统测量切片中所有含完整毛蚴的单虫卵肉芽肿面积，用标准计算纸测量肝组织面积，全部数据输入计算机，计算以下指标：a.虫卵肉芽肿大小：包括虫卵肉芽肿截面面积（mm2/个）和体积(mm3/个)；b.虫卵肉芽肿数量：即单位面积肝组织内虫卵肉芽肿的数量（个/cm2）； 肝组织虫卵计数

40、：以此作为小鼠感染程度的一个指标。称取肝组织1g，剪碎，置于小烧杯中，加入50g/L 的KOH 10ml，于37孵箱中消化12 h（过夜），直至组织消化完全，搅匀，吸取100l，涂片4 张，加盖玻片在显微镜下计数全部4 张涂片虫卵数，国家自然科学基金申请书第 15 页 版本1.011.418再乘以100，即为虫卵数/g 肝组织(EPG)。以EPG 值乘以每只小鼠的肝脏重量，即为肝脏虫卵总数； 在普通显微镜下对肉芽肿内嗜酸性粒细胞进行计数，并计算各组均值，以此作为肉芽肿炎性反应程度的另一个指标； 用免疫组织化学法(PicTure 二步法)检测肝组织中IL-4、IFN-、TGF1 及其受体、PDG

41、F 及其受体、NFB(p65)、Bcl-2、Bax 、MMP13、TIMP1 表达情况。每批实验均设立阴、阳性对照。采用MetaMorph 显微图象分析系统对图象定量分析。 用免疫组织化学法检测激活的HSC：肝组织切片在室温下与抗-SMA 单抗对切片孵育30 分钟后，再与抗鼠IgG2a-过氧化物酶结合物反应，用DAB 显色、苏木精、伊红复染。光镜下激活的HSC 呈棕褐色。用MetaMorph 显微图象分析系统对图象进行定量分析，了解HSC 被激活的情况； 用Van Gieson 苦味酸-酸性品红法对肝组织切片进行染色，胶原纤维呈红色，肌纤维、胞浆和红细胞呈黄色，细胞核呈蓝黑色。用MetaMorph 显微图象分析系统进行定量分析，以此来判断、比较肝纤维化程度；（4）分离、培养肝组织中的HSC：小鼠在给予麻醉、抗凝后，无菌下以16 号套管针作门静脉插管，灌注D-Hanks 液至肝脏充盈，剪开下腔静脉放血后结扎。用另一个16 号套管作上腔静脉插管，形成门静脉-上腔静脉循环。分别以0.1%链霉蛋白酶E、0.03%型胶原酶灌注34 分钟后取出肝脏、剪碎，用链霉蛋白酶E、DNA 酶消化后，200 目筛网过滤、Percoll 密度梯度离心、无血清RPMI1640 培养液培养。在光镜下培养原代肝星状细胞呈星形或多边形，胞浆丰富