班杨科勉精氨酸激酶的表达及纯化模板

1、精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 报告题目精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化作者姓名王小珍班级学号0802/2008114010223指导教师汪劲松完成时间2011年7月生物学实验教学中心目 录引言21实验材料、试剂、仪器42 实验方法52.1配制LB液体培养基52.2 活化菌种52.3 扩大培养52.4 IPTG诱导AK的表达62.5蛋白质提取62.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白62.7SDS-PAGE电泳鉴定纯化程度73 结果与分析83.1层析谱图83.2 SDS-PAGE电泳带型分析9总结10参考文献11致谢12精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 王小珍（指导老师：汪劲松）（

2、湖北师范学院生命科学学院 生物科学0802班 湖北 黄石 435002）摘 要：目的：研究精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化。方法：用含卡那霉素的LB液体培养基活化并扩大培养菌种，利用IPTG诱导精氨酸激酶（AK）的表达，经离心、超声波破壁获得AK粗提液。粗提液用His-tag Ni 亲和层析纯化，用SDS-PAGE电泳鉴定纯化结果。结果：层析谱图典型，SDS-PAGE电泳带型清晰，实验已分离得到了一定含量的AK，而且纯化程度较好关键词：精氨酸激酶（AK） 表达 亲和层析纯化 电泳鉴定精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 王小珍（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院 生物科学0802班 湖北

3、 黄石 435002）引言 精氨酸激酶无脊椎动物的精氨酸激酶（Arginine kinase, AK）（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.3）类似于脊椎动物中的肌酸激酶（creatine kinase ，CK）（ATP:N-肌酸磷酸转移酶）， 是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸和Mg2+ADP，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用 。AK在体内催化反应方程式如下：Mg2+ADP+Arginine phosphate Mg2+ATP+Arginine某些物种的精氨酸激酶的晶体结构已经被解析出来，AK是由一个小的螺旋组成的N端结构域和一个大的C端结

4、构域组成的，C端结构域与Glu合成酶的C端结构域相似，8股串起来的反平行折叠被7个螺旋所包绕。过渡态类似物的结合部位不在两个结构域之间，而是在C端结构域的内部。如图所示：亲和层析法 亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。His-tag所用层析凝胶的基质上连接了一个氨基三乙酸，可以与Ni离子结合，而Ni离子与融合蛋白的6Xhis之间产生吸引力，从而将带有组氨酸标签的

5、融合蛋白与其他蛋白区分开来。加样后，用平衡液可以将杂蛋白洗脱下来，再用可溶的竞争性螯合剂洗脱可回收靶蛋白。电泳电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的。一般凝胶介质中的pH维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样他们可以向阳极迁移。本实验我们做了以下工作：用含卡那霉素的LB液体培养基活化并扩大培养菌种，利用IPTG诱导精氨酸激酶（AK）的表达，经离心、超声波破壁获得AK粗提液。粗提液用His-tag Ni 亲和层析纯化，用SDS-PAGE电泳鉴定纯化结果。1 实验材料、试

6、剂、仪器1.1 材料 含AK基因的质粒的大肠杆菌1.2 试剂 LB液体培养基（100 mL）：蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，Nacl 1 g 50 mg/mL 卡那霉素（kanamycin） IPTG Binding Buffer : Tris(20 mM)，Nacl(500 mM)，加Hcl调PH至8.0 咪唑（10 mM、250 mM） 12 %的分离胶（5 mL）:成分体积（mL）水1.6030 %丙烯酰胺2.001.5 M Tris (PH 8.8)1.3010 % SDS0.0510 % 过硫酸铵0.05TEMED0.002浓缩胶 （2 mL）成分体积（mL）水1.4030 %

7、丙烯酰胺0.331.0 M Tris (PH 6.8)0.2510 % SDS0.0210 % 过硫酸铵0.02TEMED0.002样品缓冲液考马斯亮蓝R-2501.3 仪器电子天平、高压灭菌锅、单人单面净化工作台、振荡培养箱、雪山制冰机、冷冻离心机、超声破壁仪、低温恒温槽电泳仪。纯化过程中系列装置：HL-2S恒流泵、HD-3紫外检测仪、SBS100数控计滴自动部分收集器、HD-A电脑采集器、电脑。2 实验方法2.1配制LB液体培养基称取NaCl 1 g 、蛋白胨 1 g、酵母提取物 0.5 g ，加入蒸馏水，配制成100 mL的LB液体培养基，放入高压灭菌锅中灭菌。2.2 活化菌种向6 mL

8、 LB液体培养基中加入6 uL 50 mg/mL卡那霉素(工作浓度为50 ug/mL)，再接入100 uL表达菌种，于37 摇床振荡培养8-12小时。2.3 扩大培养向100 mL LB液体培养基中加入100 uL 50 mg/mL卡那霉素(工作浓度为50 ug/mL)，再加入6 mL活化的菌液，于37 恒温培养箱中培养23小时。2.4 IPTG诱导AK的表达加入IPTG培养3-4 h诱导表达。2.5蛋白质提取（1）将菌液置于离心管4 ，5000 r/m离心10 min。（2）弃上清液，向沉淀中加入蒸馏水，用漩涡混合器混匀。（3）4 ，5000 r/m离心10 min。（4）弃上清，向沉淀中加

9、入裂解液，用漩涡混合器混匀。（5）在冰上进行10 min（工作时间为2 s，间隔为3 s）的超声波破壁，一共三次，每两次间间隔5 min。(6) 于4 ，12000 rpm，离心10 min，取上清，得到AK的粗提液。 2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白（1）用Binding Buffer预洗Ni柱。（2）打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。将粗提液上柱。(3) 上样完后，用Binding Buffer （pH=8.0）淋洗。待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同梯度的咪唑（10 mM、250 mM）洗脱，在280 nm处进行连续紫外检测，根据微电脑记录仪显示

10、曲线。分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。用Binding Buffer （pH=8.0）淋洗出的洗脱液称为穿流液，10 mM咪唑洗脱出的洗脱液收集于号管中，250 mM咪唑洗脱出的洗脱液收集于号管中，号管洗脱液的收集时间介于号管和号管之间。2.7SDS-PAGE电泳鉴定纯化程度（1）安装双垂直板电泳槽；（2）配12 %的分离胶5 mL，浓缩胶2 mL；（3）制样：取样品30 µL与样品缓冲液30 µL混合，100 加热5分钟；（4）上样：用微量注射器加样。15孔的样品分别取自粗提液、穿流液、号管、号管、号管;（5）电泳：在凝胶上加80

11、V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140 V/cm继续电泳直到染料到达底部;（6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡;（7）脱色处理。3 结果与分析3.1层析谱图图1微电脑记录仪显示的His-tag Ni亲和层析法纯化AK的谱图分析以上的谱图知：上样开始后，00:00到00:06阶段被洗脱下来的溶液的吸光度基本上是持平的， 流经下来的大部分是Binding Buffer。00:06时吸光值基本上是沿直线上升的，直达至峰值，表明AK粗提液流经穿流柱后有蛋白质（杂蛋白）被洗脱下来了，经过一段时间后，杂蛋白的峰回落并且基本上是持平的，显示杂蛋白已经被洗脱完了。最后，再分别用10

12、mM、250 mM的咪唑液洗脱，得到两次的峰值，显示AK已经被洗脱下来了，而且高浓度的咪唑液洗脱出来的目标蛋白（AK）纯度相对更高。3.2 SDS-PAGE电泳带型分析图2 SDS-PAGE电泳图14孔的样品分别是依次取自粗提液、穿流液、号管、号管。（1）箭头所指的为AK相对应的相对分子质量处。（2）第2孔中的样品（穿流液）为大量除AK以外的杂蛋白，故第2个条带在箭头所指处比第一个条带颜色要浅，其余条带颜色的深浅基本上一致；（3）第3孔中的样品是用低浓度的咪唑液(10 mM)洗脱所得的，AK在此时才刚开始出现，故第3组在箭头所指处条带的颜色要较浅一些；（4）第4孔中的样品是用高浓度的咪唑液洗脱

13、下来的，AK的量大而且纯度很高，故第5组在箭头所指处条带的颜色很深。总结实验结果说明我们所做的实验已分离得到了一定含量的AK，而且纯化程度较好，即本实验结果较好，达到了预期的结果。通过本实验，我已对蛋白质的提取、His-tag Ni亲和层析法及SDS-PAGE电泳有了深刻的了解。还见识并使用了一些以前未曾使用过的仪器。本实验巩固并增加了我的理论知识，也锻炼了我的实验动手操作能力，更提高了我的实验素质及与他人协作的能力。此次实验在老师的悉心指导和同学的帮助下，我学会了很多实验操作技术，也提升了实验技能。以前做实验，人太多自己也缺乏主动性，所以很多步骤都会让同学代劳，此次实验我提醒自己不要偷懒，很

14、多能参与的步骤我都是自己动手。试验中我学会了用微量移液器及其使用时的注意事项。为了弄清实验的目的、原理、步骤，我上网查了关于该实验的资料并查阅了相关论文，期间领略了大家的风范，受益匪浅。过程中有不懂的内容我会与同学一同去探讨，有时我们也有争执但更多的是在摩擦中增进了友谊。以前做实验每次我都抱着完成任务的心态，每次都是“混”过来的，此次实验在老师的倡导和同学们的影响下我端正了实验态度，几天下来觉得做实验其实没有想象中的那么无聊，踏实地探索反而会让自己的心境变得平静。以前做实验我都是按图索骥而毫无思考，此次试验我学会了思考也学会了分析问题，也许这才是实验中最重要的。参考文献1 雷婧, 万华涛, 汪

15、劲松, 王卫东, 潘继承. 精氨酸激酶C端结构域的克隆及其表达纯化J. 化学与生物工程, 2010, 27 (6)2 周灵德, 闫玉华, 袁琳, 李世普. 大鼠骨粘连蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化J. 武汉理工大学学报, 2008, 30(5)3 薄慧杰, 卢长明, 吴刚, 武玉花. 草胺膦抗性基因bar的原核表达与蛋白质纯化J. 西北农林科技大学学报, 2007, 35(2)4 文征宇, 侯文韬, 杨龙雨, 陈鹏. 牛痘病毒拓扑异构酶I的原核表达与纯化J. 西北农林科技大学学报, 2011, 39(3)致谢衷心地感谢老师对本实验的细心指导，并感谢同组同学的合作帮助。感谢老师在实验过程中的指导，老师规范了我